原发性肝癌鸡尾酒基因治疗作用机制研究论文

SCI论文（www.lunwensci.com）:

摘要：本课题拟将人源化Apoptin在细胞核内发挥促进肿瘤细胞凋亡作用，30肽在细胞外抑制血管新生、抑制肿瘤细胞迁移、侵袭。最终产生“多轨道、多方位、多靶点”的鸡尾酒式基因治疗肝肿瘤效果。本课题是聚焦解决肝癌晚期治疗问题提出的新的研究假设。本课题拟从肿瘤细胞和宿主微环境两个维度进行“鸡尾酒式”抗肿瘤，即抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤血管新生、增加肿瘤免疫分子、抑制HBV和阻断病毒感染向癌症转化进程的抗肝癌多靶点综合性治疗。

本课题的结果将为肝癌基因治疗走向临床提供重要依据。探讨联合基因之间协同作用的共同靶点和上下游信号转导通路，为肝癌的基因治疗从基础走向临床进行有益的尝试。

关键词：肝癌；原发性肝癌；基因；鸡尾酒；凋亡素；30肽；内皮抑素

本文引用格式：高淑芹,兰天博,张凤侠,等.原发性肝癌鸡尾酒基因治疗作用机制研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(52):132,134.

0引言

原发性肝癌（HCC）是高度恶性肿瘤，发病率和死亡率分别位列恶性肿瘤的第四位和第二位[1]。肝癌细胞增殖能力、转移能力异常活跃。尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍死于术后肿瘤复发及转移。肝移植与化疗治疗效果均不显著。基因治疗已成为具有巨大潜力的治疗策略。

我们提出多维度、多靶点集中抑制肿瘤的“鸡尾酒”肝癌基因治疗方案-组合抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤血管新生、增加肿瘤免疫分子、抑制嗜肝病毒和阻断病毒感染向癌症转化进程的基因治疗，对最终清除肿瘤细胞具有重要理论及临床意义。

1研究方案

1.1改造Apoptins人源化序列

我们证明凋亡素通过与HSP70启动子区HSE结合下调HSP70表达，从而识别肿瘤细胞将其凋亡。鉴于凋亡素入核序列为两个分离区，中间区域与HSC70结合有关，因此本研究将保留凋亡素保守的结构域，因其与人类Gyrovirus序列有70%重叠，我们保留几个保守序列和共性序列，同时分析有效片段，重组至质粒中，流式凋亡率分析其促肿瘤细胞凋亡能力。

以pEGFP-C1-Apoptin为模板，PCR扩增5套凋亡素DNA片段，以pEGFP-C1为载体构建5个不同片段质粒，分别构建PEGFP-A1-69N1N2，PEGFP-A1-46N1N2，PEGFP-A1-31N1N2，PEGFP-A32-69N1N2和PEGFP-A32-62N1N2质粒。转染至HepG2细胞后，Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪，激光共聚焦检测其凋亡水平，筛选最有效序列pEGFP-Apoptin。 1.2构建联合表达载体以及AAV8病毒制备

构建凋亡素与30肽联合表达质粒，设计合成两种联合方案，一种是将Apoptin与30肽插入IRES序列CBA启动子共同表达；一种是分别有两个CBA启动子表达，因30肽不具备外分泌蛋白，在质粒构N端加入Igk分泌蛋白，C端加入His标签以作为筛选。

1.3验证AAV-Apoptin（s）/30肽对肝癌细胞生长抑制和细胞迁移与侵袭效应的体外实验研究

为验证联合基因治疗对肿瘤有更强的抑制生长和迁移、侵袭能力，通过WST-1等实验分析AAV-Apoptin（s）/30肽对肝癌细胞生长抑制能力，通过划痕愈合试验和侵袭实验证实AAV-Apoptin（s）/30肽对肝癌细胞迁移与侵袭抑制作用。

1.4验证AAV-Apoptin（s）/30肽对肝癌抑制体内实验研究

将HCC裸鼠分为4组：pAAV-CBA-EGFP组，pAAV-CBA-30肽组，pAAV-CBA-Apoptin（s）组，pAAV-CAB-Apoptin（s）-IRES-30肽组。分组6只体重相同为评价AAV-Apoptin（s）/30肽对HCC裸鼠肝肿瘤特别是较大瘤体的逆转能力，制备HCC裸鼠模型。小动物成像检测AAV8肝靶向性尾静脉，AAV给药与超声活体测量肿瘤大小，绘制生长曲线，HE染色及免疫组化检测对癌组织的逆转能力，MVD测定抑制血管新生情况，为评价AAV的安全性，检测血清AST、ALT表达水平。

2实验方法

细胞核蛋白提取：使用NE-PER核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒取各组处理后培养24h细胞PBS洗涤后按操作说明分别加入Cock-tail蛋白酶抑制剂和CERI、CERII裂解液冰上孵育、离心后取上清即为细胞浆蛋白，继续加入NER裂解液，冰上孵育、离心后上清为细胞核蛋白，蛋白经定量分析，分装，于-80℃冻存。

RNA提取：培养细胞PBS清洗，Trizol裂解细胞，加入氯仿涡旋，离心，吸取上清，加入异丙醇，离心，无水乙醇洗涤沉淀，晾干，溶解。

划痕愈合试验（Wound Healing Assay）：选取生长良好的细胞，胰酶常规消化制成细胞悬液；用含10%小牛血清的培养液调整细胞密度为1.0×105个/mL，接种于6孔培养板中，每孔2 mL；

细胞生长融合达到90%，用200L的移液器枪头，在培养板每孔中央的纵轴方向划痕，吸去原培养基，用0.01 mol/L PBS液洗3次，去除划痕区的漂浮细胞；每孔加入含无血清的培养液2 mL和AAV，37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育，在0 h、24 h、48 h分别于倒置显微镜下观察并拍照，实验设对照组和各浓度药物干预组，每组3个复孔，实验重复3次。 HCC裸鼠制备与给药：冻存的HepG2肝癌细胞常规复苏处理后，浓度至1×105个/mL，在超净台中，开腹Bal/c小鼠，按5×107个细胞/只注入Bal/c小鼠肝脏200L，缝合。SPF级环境饲养，观察成瘤情况，超声下观察肿瘤直径大约2 cm以上时，随机分成四组，A组为空白对照组，每只腹腔注射0.2 mLpAAV-CBA-EG-FP；B组为Apoptin（s）组；C组为30肽组；D组为联合基因组，每组予以200L/只尾静脉注射AAV，平行组之间条件完全相同。

超声检测体内肿瘤生长曲线：每3天超声测量一次肿瘤大小，绘制活体生长曲线。8周后处死，测量瘤体大小。
病毒靶向性检测：将待检测鼠用乙醚麻醉，利用小动物成像仪，检测注射AAV8-EGFP病毒HCC裸鼠病毒体内分布情况。

HE染色：以4%多聚甲醛固定肿瘤组织，常规石蜡包埋后3m切片，苏木素-伊红染色（HE染色），光镜下鉴定组织病理学类型及移植瘤细胞形态。ALT/AST检测：每3天取HCC裸鼠血1 mL，根据小鼠AST和ALT ELISA检测试剂盒说明书作操作。

3结果

3.1Apoptin诱导肿瘤细胞中凋亡与HSP70下调有关

Western blots实验结果证实了双向电泳和质谱鉴定的结论。结果显示凋亡素对HL 7702的Hsp 70表达几乎没有影响，专一下调HepG 2细胞中Hsp70的表达，AO/EB染色和Hoest 33342染色以及流式凋亡率分析实验结果表明：过表达的hsp70强烈抑制了凋亡素的促凋亡作用。hsp70 RNAi凋亡增强，提示Apoptin诱导肿瘤细胞中凋亡与HSP70下调呈负相关。

3.2构建并表达的TAT-Apoptin对小鼠肝癌细胞有显著的抑制作用

TAT-apoptin融合蛋白对小鼠移植型肝癌有较强抑制作用，TAT-apoptin组平均瘤重明显小于对照组（P<0.05），抑瘤率达42.46%。小鼠肿瘤病理组织切片HE染色，对照组肿瘤细胞增长非常活跃，肿瘤细胞弥散性向骨骼肌内侵入，肿瘤中心仅有散在坏死灶；TAT-apoptin组实体瘤中心有大片肿瘤细胞坏死。

3.3内皮抑素30肽具有比内皮抑素更强的抑制血管新生和抗肿瘤能力

利用基因工程手段重组人皮抑素30肽，定点诱变N端为RGDRGD序列，原核基因表达重组后，电泳纯化得到30肽，注射H 22肝癌小鼠，肿瘤组织切片HE染色可见，对照组肿瘤细胞生长良好，坏死区少见，血管丰富。30肽和RGD 30肽组均可见肿瘤细胞大面积坏死灶但RGD30肽组的抑制作用更明显。

3.4Apoptin与30肽联合应用时，有更强的促进肿瘤凋亡和抑制迁移能力

将Apoptin与30肽质粒共转染HepG2细胞中，划痕实验表明，两者联合应用相较于单独使用30肽有更强的抑制细胞迁移能力。Annexin-V-FITC/PI流式分析结果显示，单独转染Apoptin凋亡细胞为40.67%，联合Apoptin与30肽作用于HepG2后，凋亡细胞为55.13%，提示联合作用有更强的抑制肿瘤凋亡作用。

4结论

原发性肝癌是高度恶性肿瘤，发病后病人的生存期很短、死亡率高、有耐药性，临床采用的多种传统治疗手段均不理想。基因治疗在肝癌中的作用越来越重要，其中联合基因治疗相互协同，是更加有效的抗肿瘤手段。

凋亡素（Apoptin）可以特异诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞不起作用。研究发现人类Gyrovirus与凋亡素在序列上有70%的相似度，因此在保留Apoptin功能的前提下，根据人类Gyrovirus相同功能序列合理改造成“人体内源蛋白-Apoptin”对其在临床应用具有极为重要的意义。

本研究拟将人源化Apoptin在细胞核内发挥促进肿瘤细胞凋亡作用，与在细胞外抑制血管新生、抑制肿瘤细胞迁移、侵袭。Apoptin与30肽联合应用时，有更强的促进肿瘤凋亡和抑制迁移能力，构建联合高效表达Apoptin（s）/30肽的病毒载体，细胞水平与动物水平证实对于晚期较大瘤体有很强的抑瘤能力；最终产生“多轨道、多方位、多靶点”的鸡尾酒式基因治疗肝肿瘤效果。本课题的结果将为肝癌基因治疗走向临床提供了重要依据。

参考文献

[1]Zhao Y,Li Z,Sheng W,et al.Radiosensitivity by ING4-IL-24 bicistronic adenovirus-mediated gene cotransfer on human breast cancer cells[J].Cancer Gene Therapy,2013,20(1):38-45.
[2]陶站华,刘兴汉,张宇雯,等.TAT-凋亡素融合蛋白的表达及其抗肿瘤活性[J].中国生物化学与分子生物学报,2006,22(7):535-541.
[3]任明华,王淑静,林雪松,等.重组人内皮抑素的结构改造及抗肿瘤活性变化[J].中国生物化学与分子生物学学报,2005,21(1):45-52.

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