[摘要]目的探究熊果苷对小鼠卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响。方法使用含有不同剂量的熊果苷（0、10、20、40µmol/L，分别设为对照组、10µM组、20µM组、40µM组）培养基对生发泡（germinal vesicle,GV）期小鼠的卵母细胞进行16 h体外培养，监测卵母细胞成熟率和活性氧物质（reactive oxygenspecies,ROS）含量。体外受精后将受精卵转移到相同的培养基中，观察卵裂率和囊胚率的变化。结果补充熊果苷培养基的卵母细胞的体外卵母细胞成熟度高于对照卵母细胞，其中40µM组（100%）明显高于对照组（50%），差异有统计学意义(χ2=10.526，P=0.001）。4组的第一极体排出率比较，差异无统计学意义（P均>0.05）。10µM组、20µM组、40µM组卵母细胞内的ROS荧光强度均低于对照组，差异有统计学意义（P均<0.05）。4组囊胚率比较，差异无统计学意义（P均>0.05）。结论在成熟液中添加适量熊果苷能降低卵母细胞中的ROS水平，但对小鼠胚胎发育无明显影响。
[关键词]小鼠,体外成熟,氧化应激,熊果苷
控制性促排卵（controlledovarian hyperstimula⁃tion,COH）产生的卵子中约有15%是不成熟的[1-2]。卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）是通过使用卵巢腔内的未成熟卵丘卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COC）实现。IVM提高了卵子质量，降低了卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）的发生率，但在辅助生殖领域使用IVM仍面临许多问题。通过体外受精（in vitro fertiliza⁃tion,IVF）获得的受精卵质量较差，体外受精率、囊胚形成率、植入率和妊娠率明显较低。体外培养基中的氧化应激是导致卵子成熟潜能发生变化的一个重要因素[3-4]。活性氧物质（reactive oxygenspe⁃cies,ROS）可导致DNA损伤、线粒体功能障碍、脂质过氧化和蛋白质氧化，以上都会对卵细胞的发育产生负面影响。在体外培养过程中，促氧化剂是细胞新陈代谢所必需的物质，当这些物质的平衡被打破时，就会产生氧化应激。熊果苷（arbutin,Ar）是一种新型抗氧化剂，其主要成分熊果苷（对苯二酚）具有良好的抗炎和抗氧化活性。Ar对动物卵母细胞生成及发育的影响尚不清楚。因此，本研究旨在通过在体外培养基中添加适当浓度的熊果苷，探讨其对小鼠卵母细胞质量和胚胎发育的影响，为临床IVM技术提供新思路。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
6~8周龄（50只）美国癌症研究所（institute of cancer research,ICR）雌鼠和10周龄（20只）ICR雄鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，在无菌的条件下饲养，12 h光照，12 h黑暗。
1.2实验试剂及设备
本研究使用试剂及设备主要为：孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）（宁波三生生物科技有限公司）、人类输卵管液（hu⁃man tubal fluid,HTF）（美国In-Vitro Fertilization公司）、M2培养基、M16培养、纯矿物油（均来自Sigma公司）、熊果苷（MCE公司）、活性氧检测试剂盒（Beyotime公司）。
1.3未成熟卵母细胞的收集与培养
1.3.1收集未成熟的小鼠卵细胞性成熟前将PMG 10 IU/kg注射到雌鼠腹部，48 h后颈椎脱臼法处死小鼠，采集整个卵巢，立即放入预热的M2培养基中。采集一小部分卵巢，用M2溶液洗涤3次，选择一个大而透明的卵泡，穿刺后将积层COC排入培养基中。选取一整组有3~10个边缘略微分散的COC的积层细胞，放入1 mL的M2杯中待用。
1.3.2小鼠卵母细胞体外成熟培养将清洗后的卵母细胞分为4组，分别在预平衡M16培养基（Ar浓度分别为0、10、20和40µmol/L，分别设为对照组、10µM组、20µM组、40µM组）中培养16 h。统计卵细胞成熟率[处于第二次减数分裂中期（meta⁃phase of the second meiosis,MⅡ)细胞的占比]。
1.4小鼠体外受精
1.4.1采集精子每组选取1~2只小鼠，颈椎脱臼法处死后无菌解剖，暴露生殖器官。立即取出附睾尾部，去除脂肪后，用4号注射器穿刺附睾，用针尖吸取黄色黏液，放入事先准备好的HTF培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养0.5 h。
1.4.2体外受精选择具有第一极体的正常MⅡ卵母细胞。在37°C、5%CO2和相对饱和湿度条件下进行IVF。
1.4.3小鼠早期胚胎培养体外受精6 h后，将卵母细胞转移到含Ar的M16培养基中。受精后96~120 h可观察到囊胚形成。
1.5 ROS染色
为评估Ar处理后卵母细胞的ROS水平，使用活性氧检测试剂盒（Beyotime）对4组（Ar浓度分别为0、10、20、40µmol/L）IVM卵母细胞进行测定。将卵母细胞清洗3次，转移至含10µM 2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）的培养基中，于培养箱中孵育30 min。孵育结束后，清洗3次，转移至载玻片上，并用激光共聚焦显微镜拍照。每组实验至少重复3次。
1.6统计方法
采用SPSS 23.0统计学软件处理数据，经Shapiro-Wilk检验符合正态分布的计量资料（卵母细胞数、ROS荧光强度）以(±s）表示，组间比较行两独立样本t检验。计数资料（成熟率、第一极体排出率、囊胚率）以例数（n）和率（%）表示，组间比较行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 4组小鼠卵母细胞体外成熟情况比较
10µM组、20µM组、40µM组体外卵母细胞成熟率高于对照组，其中40µM组明显高于对照组，差异有统计学意义（P均<0.05）。4组的第一极体排出率比较，差异无统计学意义（P均>0.05），见表1。
2.2 4组卵母细胞内ROS水平、小鼠胚胎发育情况比较
10µM组、20µM组、40µM组卵母细胞内的ROS荧光强度均低于对照组，差异有统计学意义（P均<0.05），见表2。4组囊胚率比较，差异无统计学意义（P均>0.05），见表3。
3讨论
IVM是临床上最常用的人工生殖技术之一，但在传统的体外培养系统中，氧化应激或氧化与抗氧化平衡失调会对卵细胞造成不可逆的损伤。氧化应激是ROS生成过多引发扩张型心肌病的主要机制之一，糖脂代谢调节紊乱会导致细胞内ROS的产生和清除失衡，脂质过氧化的产物和晚糖基化的最终产物[5-6]。ROS是一种重要的氧化剂，可氧化所有物质并改变其结构和功能。研究表明，在不同培养物中添加抗氧化剂可有效改善卵细胞质量，促进胚胎发育[7-8]。Ar是一种具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性的天然产物。在本研究中发现，补充40µmol/L AR可明显加快小鼠卵细胞的体外成熟，从而改善胚胎的后续发育，但第一极体排出率基本相同。对照组、10µM组、20µM组卵母细胞体外成熟情况比较，差异无统计学意义（P均>0.05），该结果与易疆莺等[7]研究结果一致，表明添加10~20µmol/L浓度的Ar对卵母细胞的成熟没有明显影响。
Ar作为一种黑色素抑制剂，通过清除自由基和直接清除ROS，可以调节超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化基因的产生，抑制氧化酶降低氧化压力。张俊等[8]研究表明，在牛体外成熟液中添加一定剂量的褪黑激素，可提高细胞器中的谷胱甘肽和ATP水平，上调抗氧化相关基因的表达，改善受精和卵母细胞发育。本研究中，在培养液中添加40µmol/L Ar能显著降低卵子成熟过程中的ROS含量和细胞凋亡，这表明40µmol/L Ar对卵母细胞的成熟程度具有直接影响[9]。由此也进一步证实，Ar能有效保护损伤细胞的增殖活力，减少氧化应激造成的损伤。此外，彭巍等[10]、张贝贝等[11]研究证明熊果苷降低细胞内ROS水平，与本研究中添加熊果苷后10µM组、20µM组、40µM组卵母细胞内的ROS荧光强度均低于对照组，本研究在胚胎培养基中加入Ar，结果发现10µM组和20µM组处理后囊胚率增加，40µM组囊胚率略有下降，但差异无统计学意义（P均>0.05），因此本研究认为添加Ar不会影响胚胎的发育。有研究表明，熊果苷可以降低B16小鼠黑色素瘤细胞的细胞活力，诱导线粒体断裂[12]，过量添加Ar导致发育率降低与线粒体的关系将是下一步的研究方向。
综上所述，适宜浓度的Ar对小鼠胚胎体外囊胚率略有提高，但是并无显著差异。上述结果表明添加熊果苷可以改善卵母细胞和胚胎发育的体外微环境，有利于提高质量，为临床培养基的研制提供新的思路。
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