基于水通道蛋白清窍胶囊（Qingqiao Capsule）治疗分泌性中耳炎小鼠模型机制的研究论文（附论文PDF版下载）

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摘要：目的 基于水通道蛋白研究院内制剂“清窍胶囊”（Qingqiao Capsule）治疗分泌性中耳炎（SOM）小鼠模型的机制。方法 随机将小鼠分为实验组、对照组、正常组三组，实验组及对照组使用卵清蛋白腹腔注射致敏，鼓室内注射激发制备分泌性中耳炎小鼠模型； 实验组予以清窍胶囊 0.50mL（0.02mg/kg）灌胃，每日三次；对照组予以等量安慰剂（淀粉）灌胃，每日三次；正常组予以正常饲养， 各组均在同等条件下饲养 10 天，采用 ELLSA 方法对各组小鼠外周血清及中耳黏膜裂解液中的水通道蛋白 AQP1,4,5 进行含量检测并统计。结果 实验组 SOM 小鼠模型血清AQP1,5 表达浓度较对照组明显升高（P<0.01），而 AQP4 表达浓度较对照组显著降低（P<0.05）； 中耳黏膜AQP1,5 表达浓度较对照组明显升高（P<0.01），但 AQP4 表达浓度与对照组相比略微降低，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 清窍胶囊能明显提高 SOM 小鼠血清中 AQP1,5 的表达量，降低 AQP4 的表达量；提高小鼠中耳黏膜中 AQP1,5 的表达水平，但对中耳黏膜 AQP4 的表达水平无明显影响。显示清窍胶囊可能通过调节水通道蛋白AQP1,4,5 的表达干预分泌性中耳炎（SOM）中耳黏膜水液的输布，调节中耳黏膜水平衡，促进中耳积液的清除，对改善分泌性中耳炎的转归有着积极明显的作用。

关键词：清窍胶囊；分泌性中耳炎（SOM）；水通道蛋白；小鼠模型

本文引用格式：童兴科 , 孙永东 , 向小红 . 基于水通道蛋白清窍胶囊（Qingqiao Capsule）治疗分泌性中耳炎小鼠模型机制的研究 [J]. 世界最新医学信息文摘 ,2018,18(72):20-21,23.


ABSTRACT: Objective Based on aquaporins, the mechanism of Qingqiao Capsule in treating secretory otitis media (SOM) mice  was studied. Methods   The mice were randomLy divided into three groups: experimental group, control group and normal group.    The experimental group and control group were sensitized by ovalbumin intraperitoneal injection and intraperitoneal injection in the tympanum to prepare the mice model of secretory otitis media. The experimental group was given the Qing Qiao capsule 0.50mL (0.02mg/kg) gavage, three times a day, and the control group was given a placebo (the placebo group). Starch) gavage, three times a  day. The stomach, three times a day, the normal group was given normal feeding, and all the groups were kept under the same condition for 10 days. The ELLSA method was used to determine the content of the aquaporin AQP1,4,5 in the peripheral serum and the middle ear mucosa lysate of the mice. Results The serum AQP1,5 expression concentration of SOM mice in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P<0.01), while the expression concentration of AQP4 was significantly lower than that of the control group (P<0.05), and the concentration of AQP1,5 in the middle ear mucosa was significantly higher than that in the control group (P<0.01), but the expression concentration of AQP4 was slightly lower than that in the control group, and the difference was not statistically significant. Meaning (P>0.05). Conclusion The Qing Qiao capsule can significantly increase the expression of AQP1,5 in the serum of SOM mice, reduce the expression of AQP4 and improve the expression of AQP1,5 in the middle ear mucosa of mice, but have no obvious effect on the expression level of AQP4 in the middle ear mucosa. It is shown that the Qing Qiao capsule may regulate the distribution of water in the middle ear mucous membrane of the secretory otitis media (SOM) by regulating the expression of water channel protein AQP1,4,5, regulate the water balance of the middle ear mucosa, promote the clearance of the middle ear effusion, and have a positive and obvious effect on the improvement of the outcome of the secretory otitis media.
KEYWORDS: Qing Qiao capsule; Secretory otitis media (SOM); Aquaporins;mouse model


引 言

分泌性中耳炎 (Secretory otitis media ,SOM) 是指中耳腔存在积液而不伴有急性感染症状或体征为特征的一类疾病， 临床症状表现为听力下降、耳胀、耳鸣、轻度耳痛，是耳鼻喉科常见疾病 [1]。关于 SOM 的病因及发病机制至今尚未完全阐明，也未有统一的共识，目前认为主要与咽鼓管功能障碍、感染、及免疫功能异常有关 [2]。

中耳腔积液的清除及正常含气状态的维持是治疗分泌性中耳炎的重要环节，如何快速有效的清除中耳积液，尽快恢复中耳的正常含气状态，维持中耳粘膜的液 - 气平衡功能是每个临床医务人员面临的难题。大量研究表明，中耳腔液体的转运和平衡主要依赖于咽鼓管的清除功能和中耳粘膜上皮 ( 特别是纤毛上皮 ) 的吸收和分泌功能 [3]。因此研究中耳腔的液体平衡机制对了解分泌性中耳炎的发病机理和临床治疗有重要意义。

水通道蛋白 (aquaporins,AQPs) 最先是被作为穿细胞内质膜的水分子转运孔道提出，可以选择性地高效转运水分子，广泛分布于人体各组织，对体内液体转运过程中起着重要的作用 [3]，由 Benga  G 首次发现，后被证实并命名为 AQP1[4]，其后广大学者对 AQPs 进行了全面深入的研究。目前，研究人员在哺乳动物体内至少已发现 13 种 AQPs，随着对水通道蛋白的长期深入研究发现，中耳黏膜的纤毛上皮细胞表达着大量的 AQP1,4,5，并参与中耳液体的转运与平衡，对维持中耳粘膜的液 - 气平衡功能有着积极作用 [5][6]。清窍汤是我科自拟治疗分泌性中耳炎的经验协定方药，方含玄参、丹参、牛膝、薏苡仁等，具有解热、扩血管、活血祛瘀、抑菌抗菌作用。我科 2002 年开始将作为汤剂给以病人口服治疗，2008 年批准生产为院内制剂“清窍胶囊”。至今，我科各研究员已对其进行了大量相关研究，包括动物毒理实验、临床观察，临床有效性实验等研究表明，该制剂可以缓减中耳分泌液的产生，促进中耳积液的吸收，改善咽鼓管功能，同时可以改善机体免疫功能和中耳黏膜的排泄清理功能，另外还可以改善耳蜗微循环，提高听力，但其治疗分泌性中耳炎的相关机制尚不明确，也缺乏相关进一步研究 [7][8]。本文旨在研究“清窍胶囊”对分泌性中耳炎（SOM）小鼠模型水通道蛋 白 AQP1,4,5 表达的影响，探讨其对治疗分泌性中耳炎的可能机制。

1资料与方法

1.1一般资料
选取 48 只健康纯种昆明小鼠，体重在 50~80g 之间，不限雌雄，所有小鼠均无药物使用及噪音暴露史，耳内镜检查小鼠外耳道及鼓膜无异常。

1.2方法
随机将 48 只小鼠分为实验组、对照组及正常组，实验组22 只（血清组 10 只，中耳粘膜组 12 只共 24 耳），对照组 22只（血清组 10 只，中耳粘膜组 12 只共 24 耳），正常组 4 只。

实验组及对照组参照刘华，赵守琴 [9] 等建造分泌性中耳炎小鼠的模型方法：卵清蛋白腹腔注射致敏 + 鼓膜内注射激发， 分别于第 1、第 8 天采用卵清蛋白 0.30mg(ovalbumin,OVA, 纯度 >99%，Sigma, 上海生物制剂公司 ) 溶于 0.15mL 磷酸盐缓冲液 (phosphate  buffered  saline,PBS)，再以 1.28  mg 氢氧化铝( 购自上海化学试剂公司 ) 溶于 0.15mL PBS 作为免疫佐剂行腹腔注射 , 此为全身致敏阶段；第 15 天以 1% 戊巴比妥钠，50mg/kg 腹腔注射麻醉后，将 0.10mg OVA 溶于 10 lPBS 后， 在低倍显微镜下，于鼓膜前下象限注入 OVA 溶液，隔日再次麻醉观察鼓膜情况，并重复注射 1 次，此为耳内激发阶段。
正常喂养 3 日，以耳内镜观察鼓膜情况，观察鼓膜确无破裂并见积液征则表示造模成功。实验组予以清窍胶囊以 0.04g/kg 溶于 1mL 蒸馏水灌胃，每天三次，持续 10 天；对照组予以等量淀粉溶于蒸馏水灌胃。正常组仅予以等量生理盐水腹腔注射，余不做任何处理，正常饲养。

10 天后，将血清组小鼠共 22 只按实验组、对照组、正常组编组编号心脏采血，常规离心取血清，中耳黏膜组共 22 只小鼠和采血后的 4 只正常组小鼠快速断头处理后，低倍显微镜下剥离中耳黏膜，以同一只小鼠 2 耳中耳黏膜为一个标本， 以 PIRA 组织裂解液（强，购自西安郝特公司）0℃环境下充分裂解，高速离心取上清液，-80 充冰箱冰冻保存，检测方法采用 ELLSA，试剂为：小鼠水通道蛋白 1（AQP-1）ELISA 检测试剂盒、小鼠水通道蛋白 1（AQP-1）ELISA 检测试剂盒、小鼠水通道蛋白 1（AQP-1）ELISA 检测试剂盒（均购自上海蔚廷商贸有限公司），对各标本 AQP1、4、5 含量进行检测。

1.3统计方法
采 取 SPSS 20.00 统 计 软 件 包 分 析 数 据，计 量 数 据以 ( ±s）表示，组间比较采用两独立样本 t 检，以 P<0.05 表示比较差异有统计学意义。

2结果

各组小鼠 AQPs 蛋白含量见表 1。


3讨论

SOM 发病的具体机制还不明确，目前认为中耳的液 - 气平衡破坏，中耳积液是 SOM 发病的中心环节。一系列的病因如咽鼓管功能障碍、感染、免疫异常等导致正常中耳含气状态消失，中耳负压形成，中耳腔内粘膜静脉扩张导致血管通透性增强，杯状细胞增多且分泌亢进，鼓室出现积液，继而发病 [10]。张倩 [11] 等通过实验认为 AQP1,4,5 介导水分子循渗透压梯度的高效转运，并且维持中耳腔正常的含气无液状态。梁书锋 [12] 等通过实验认为分泌性中耳炎可能是由于AQPs 的失调而引起纤毛周围液体的减少，从而造成粘液液纤毛运输功能的下降，继而导致中耳腔积液。

目前为止，大量研究已证明正常哺乳动物中耳黏膜有广泛的水通道蛋白 AQP1,4,5 表达，并且 AQP1 主要位于黏膜固有层毛细血管内皮细胞和成纤维细胞，AQP4 主要存在于纤毛细胞基底侧质膜，而 AQP5 主要分布于纤毛上皮细胞的顶端膜 [5][13]，并且既往的研究结果显示，水通道蛋白 1,4,5亚型相对于其他亚型可以增加水的通透性 20 倍 [14]，证明AQP1,4,5 对于中耳腔积液的形成与清除扮演者重要的角色。本次研究显示实验组小鼠 AQP1,5 在血清中的表达水平明显高于对照组（P<0.01），而 AQP4 表达水平明显低于对照组（P<0.01），但与正常组持平，表明清窍胶囊能明显促进小鼠血清中 AQP1,5 的表达水平，降低 AQP4 在血清中的表达量， 血清中 AQP4 表达水平较低可能是 AQP1,4 和 5 在血清中协调表达的结果。AQPs 亚型在中耳黏膜的不同的定位、特性及表达水平差异，表明中耳的液体平衡需要这些 AQPs 亚型的协调运行。并且，在中耳黏膜中，实验组小鼠 AQP1,5 的表达水平均高于对照组（P<0.01），而 AQP4 表达水平与对照组基本相同，但都高于正常组，表明可能清窍胶囊对 AQP4 在小鼠中耳黏膜的表达无干预作用，也有可能是 AQP1,4,5 各亚型之间相互协调表达的结果。

虽然每一种 AQP 在中耳调节水平衡中的具体作用还不清楚，但可以明确的是液体积聚是 SOM 的主要病理机制和重要发病环节，而水通道蛋白对于液体的转运扮演着重要角色，AQP1,4,5 肯定参与了中耳积液的形成和吸收，并且各亚型之间存在着协调表达 [15]。我科院内制剂清窍胶囊经多年临床观察，一个疗程的有效率可达 91.1%[7]。本次研究结果显示清窍胶囊能明显促进分泌性中耳炎小鼠 AQP1,5 在血清和中耳黏膜中的表达，降低血清中 AQP4 的表达，影响各亚型之间的协调表达，促进中耳积液的吸收，维持中耳液体平衡。中医中药治疗分泌性中耳炎有着切确的疗效，值得肯定，对改善患者的症状、缩短病程、减少复发、提高生活质量具有重要意义，本次研究为清窍胶囊对治疗 SOM 的有效治疗提供新的理论机制视角，探索新的研究方向，对未来对于中西医结合治疗 SOM 起到积极促进作用。但清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的具体多靶点、多分子水平、信号通路等方面的作用机制，三种 AQPs 亚型在 SOM 的发病中分别扮演着什么样的角色，相互之间的功能协调平衡机制如何，还有待于更加深入的研究。

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