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摘 要：目的 研究白细胞介素 2（IL-2）和白细胞介素（IL-21）刺激自然杀伤细胞（NK 细胞）对裸鼠胶质瘤动物实验模型中 U251 胶质瘤的抗肿瘤作用。方法 将实验裸鼠分为 11 组，记录各个实验组肿瘤生长所用时间、肿瘤重量、以及小鼠生长情况，得到数据，利用统计学原理性统计学分析。结果 NK 细胞可对胶质瘤产生抗肿瘤作用，抑制肿瘤的生长，且白细胞介素可加强 NK 细胞对肿瘤的抗肿瘤作用。结论 NK 细胞对胶质瘤具有抗肿瘤的作用，且白细胞介素 IL-2、IL-21 对 NK 细胞抗肿瘤具有较好的加强作用，而白细胞介素 IL-2、IL-21 与NK 细胞之间的联系仍需进一步研究。
关键词： 胶质瘤；自然杀伤细胞；白细胞介素
本文引用格式：崔洪玮, 张振国, 孙子雯.IL-2+IL-21 刺激NK 细胞对小鼠模型胶质瘤的抗肿瘤作用 [J]. 世界最新医学信息文摘 ,2018,18(73):97+282.
0引言
胶质瘤（glioma）是来源于神经上皮的肿瘤，为最常见的原发性颅内恶性肿瘤 [1]，占颅内肿瘤的 50%-60%。按形态学划分为星形细胞瘤、少枝细胞瘤、室管膜瘤及混合胶质细胞瘤（如少枝 - 胶质细胞瘤）等。按照世界卫生组织（WHO） 制定的分级可将胶质细胞瘤按照由恶性程度最低、预后较好的Ⅰ级至恶性程度最高、预后最差的Ⅳ级，其中Ⅰ - Ⅱ级为低级别胶质瘤（分化良好，预后可），Ⅲ - Ⅳ为高级别胶质瘤（低分化，预后差）。我们从免疫细胞抗肿瘤治疗的角度出发，观察在 IL-2、IL-21 刺激下 NK 细胞对胶质瘤的抗肿瘤作用，以期为今后研究自体免疫治疗胶质瘤提供新思路。
1材料和方法
1.1NK 细胞的获取。
采集志愿者的外周血 70 mL，利用肝素抗凝并加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）行稀释处理；再加入淋巴分离液 10mL，行离心处理 15 min。
1.2小鼠模型。
裸鼠分组：将 BALB/c 裸鼠置于无菌环境下饲养，随机分组，每组 10 只（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M、N）；A 为无菌裸鼠空白对照组，B 体内移植 U251 肿瘤细胞组，C 体内注射 IL-2 组，D 体内注射 IL-21 组，E 体内注射 NK 细胞组，F 体内注入 IL-2 和 NK 细胞组，G 体内注射IL-21 和NK 细胞组，H 体内注射IL-2、IL-21 和NK 细胞组，I 体内注入 U251 细胞和 NK 细胞组，J 体内注入 U251 细胞、IL-2 和 NK 细胞组，M 体内注入 U251 细胞、IL-21 和 NK 细胞组，N 体内注入 U251 细胞、IL-2、IL-21 和 NK 细胞组。
小鼠模型建立：将培育的 U251 胶质瘤细胞经胰蛋白酶消化、离心，使用无血清 DMEM/F12 培养基制成胶质瘤细胞悬液，使用 0.2 mL 注射器经细胞悬液经皮下注射入BALB/c 裸鼠的背部皮下。取经纯化的 NK 细胞悬液，将其使用 0.2 mL 注射器经小鼠尾静脉注入其体内。取 0.2 mL 注射器分别取 IL-2 和 IL-21 使用同样的方式注入小鼠体内。以上操作均在同一时间段完成且先完成胶质瘤细胞的注入。
观察肿瘤组织的生长情况： 自裸鼠接种胶质瘤细胞、IL-2、IL-21 以及 NK 细胞起便开始观察小鼠生长情况及肿瘤生成状况。记录裸鼠背部生成肿瘤时间，记录每日肿瘤的最大长径 length（mm）和最长宽度 width（mm），肿瘤体积计算公式：V=（length x width2）/2[2]。在肿瘤出现的第 21d 处死出现肿瘤的裸鼠，解剖裸鼠的肿瘤组织，测量其重量。
1.3统计学分析。
使用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，经正态性检验，各组数据均符合正态分布，用均值加减标准差（±s）表示，五组数据符合方差齐，组间差异比较采用方差分析，有统计学意义时，进一步用 LSD 法做两两比较，P < 0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组裸鼠生存情况及瘤体生长情况。
五组裸鼠出现瘤体时间差异有统计学意义（P < 0.05），进一步做两两比较可知， 五组裸鼠出现瘤体时间呈逐渐延长趋势，除 M 组与 J 组差异无统计学意义（P > 0.05）外，其它两两组间差异均有统计学意义（P < 0.05），详情见表 1。
2.2各组实验组中出现肿瘤时间统计情况。
通过数据记录，B、I、J、M、N 实验组中均有肿瘤形成，肿瘤出现时间如下表结果显示，五组裸鼠体内肿瘤重量差异有统计学意义（P < 0.05）， 进一步做两两比较可知，五组裸鼠体内肿瘤重量呈逐渐下降趋势，除 M 组与 J 组差异无统计学意义（P> 0.05）外，其它两两组间差异均有统计学意义（P< 0.05），详情见表 2。
3讨论
本实验将裸鼠为实验对象，把 U251 胶质瘤细胞植入裸鼠体内并将提取自人体的 NK 细胞与 IL 一同注入裸鼠体内行细胞免疫治疗的方法，以建立神经胶质瘤裸鼠试验模型， 观察 NK 细胞对 U251 胶质瘤裸鼠试验模型的抗肿瘤作用。本实验研究显示：胶质瘤细胞不论在体外进行长期保存、培养、传代及裸鼠体内的生长情况，可见胶质瘤细胞的生物学特性是不可忽视的。用过对 B、I、J、M、N 实验组的观察， 我们可以发现，在使用 NK 细胞和 IL-2、IL-21 的实验组中， 肿瘤出现的时间明显低于 B 组，可见 NK 细胞对胶质瘤细胞具有抗肿瘤作用；同时 IL-2、IL-21 的参与增强了 NK 细胞对肿瘤的生长及侵袭的限制，IL-2、IL-21 不仅能能诱导 NK 细胞，而且诱导细胞毒 T 细胞以及淋巴因子激活杀伤细胞等分化，诱导产生多种细胞因子的产生，增强穿孔素的表达，而高强度的细胞因子（IFN-γ）及穿孔素有进一步增强 NK细胞的活性，从而抑制胶质瘤的生长和侵袭。另外，IL-2、IL-21 之间是否有协同效应实验中效果并不明显，且 NK 的提纯并不能做到 100%，是否会有其他细胞的参与亦是影响实验结果的因素，所以我们仍需时间进一步探讨解决此问题 [3]。综上所述，本实验初步探索了 NK 细胞对胶质瘤的抗肿瘤作用以及白细胞介素 IL-2、IL-21 对 NK 细胞抗肿瘤的协同作用，而白细胞介素 IL-2、IL-21 与 NK 细胞之间的联系仍需进一步研究。希望本篇研究能够在临床诊疗中使用细胞免疫疗法治疗胶质瘤起到一定的帮助和方向。
参考文献：
[1]Boiardi A,Bartolomei M,Silvani A,et al.Intratumoral delivery of mitoxantrone in association with 90-Y radioimmunotherapy (RIT) in recurrent glioblastoma [J].J Neurooncol,2005,72(2):125-131.
[2]Dahlberg CI,Sarhan D,Chrobok M,et al.Natural Killer Cell- Based Therapies Targeting Cancer:Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity [J].Front Immunol,2015,6:605.
[3]李澜, 刘铁强, 刘志青,等.IL-21单独或联合 IL-15 /IL-2 对G-CSF动员人外周血单个核细胞体外增殖和抗肿瘤活性作用研究 [J]. 中国实验血液学杂志,2008,16(2):350-354.
《IL-2+IL-21刺激NK细胞对小鼠模型胶质瘤的抗肿瘤作用论文》附论文PDF版下载：
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