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【摘要】目的 探讨利拉鲁肽对高糖环境下牙周膜成纤维细胞(PDLF )凋亡的影响，为糖尿病合并牙周疾病的治疗提供依据。方 法 选取 2019 年 12 月广州医科大学附属惠州医院接受正畸治疗需拔出的前磨牙的 5 名志愿者， 取牙周膜组织标本， 体外培养 PDLF ，根 据培养液成分设置为低糖对照组(5.5 mmol/L 葡萄糖) 、高糖组(25 mmol/L 葡萄糖) 、低糖给药组(5.5 mmol/L 葡萄糖 +1× 10-7 mmol/L 的利拉鲁肽) 及高糖给药组(25 mmol/L 葡萄糖 +1× 10-7 mmol/L 的利拉鲁肽) 。应用流式细胞仪测定细胞凋亡情况;采用Western Blot 法 测定牙周膜成纤维细胞中 B 细胞淋巴瘤 -2 基因(Bcl-2)、Bcl-2相关 X 蛋白(Bax )表达水平;采用酶联免疫吸附法检测 PDLF 悬液炎症 因子肿瘤坏死因子 -α(TNF-α ) 、白细胞介素 -1β(IL-1β) 、白细胞介素 -6(IL-6 )、C- 反应蛋白(CRP )的表达。结果 低糖对照组、 低糖给药组、高糖对照组和高糖给药组细胞凋亡率分别为( 4.97±0.15 )%、(3.07±0.12 )%、( 11.33±1.10 )%、(5.87±0.49 )% 。 与低糖对照组比，高糖对照组细胞凋亡率显著升高;且低、高糖给药组凋亡率显著低于低、高糖对照组;低糖对照组的 Bax 蛋白相对表 达量低于高糖对照组，Bcl-2 蛋白相对表达量高于高糖对照组;低、高糖给药组 Bax 蛋白相对表达量分别低于低、高糖对照组，低糖给 药组均低于高糖给药组;Bcl-2 蛋白相对表达量分别高于低、高糖对照组，低糖给药组均高于高糖给药组;低糖对照组细胞中 TNF-α 、 IL-1β 、IL-6 、CRP 水平低于高糖对照组;低、高糖给药组细胞中炎症因子水平分别低于低、高糖对照组，且低糖给药组低于高糖给药组 (均 P<0.05 )。结论 利拉鲁肽能够抑制高糖诱导的 PDLF 凋亡，调控 Bax/Bcl-2表达，降低炎症反应，可促进牙周组织愈合修复。
牙周病是一种常见的口腔疾病，主要因牙菌斑内细 菌及代谢产物破坏牙周支持组织，导致牙龈炎症或出血、 牙齿松动的病症，严重者可引起牙齿移位或脱落。牙周 膜成纤维细胞(PDLF)是牙周组织中一种重要的多能细 胞，通过不断生长分化形成新的纤维和牙骨质，参与牙周 组织的修复过程，对维持牙周膜完整性具有至关重要的 作用 [1] 。有多项研究显示，高血糖会刺激 PDLF 产生炎症 因子，促进细胞凋亡，加剧牙周组织的破坏，进而诱发 牙周疾病 [2-3]。糖尿病合并牙周疾病患者， 当血糖状况得 到有效控制后，配合牙周局部基础治疗，牙周病变会明显 好转，但在实际临床上，部分患者血糖控制不佳，牙周基 础治疗无法顺利开展，因此，研究高糖环境下牙周损伤 的修复具有重要意义。利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽 -1 (GLP-1)类似物，主要用于二甲双胍或磺脲类药物控制不 佳的糖尿病患者的治疗。有报道称，利拉鲁肽能够降低血 糖、减轻炎症反应、改善心血管功能 [4] ，但其对糖尿病合 并牙周疾病的影响报道较少。基于此，本研究通过体外培养人牙周膜成纤维细胞，观察利拉鲁肽对高糖环境下细胞 凋亡及炎症因子的影响，探讨利拉鲁肽对糖尿病合并牙周 疾病的保护机制，为糖尿病合并牙周疾病的治疗提供依据， 现报道如下。
1 材料与方法
1.1主要实验材料 利拉鲁肽注射液(丹麦诺和诺德公 司，国药准字 J20160037.规格： 3 mL ∶ 18 mg )，DMEM 培养基(美国 Gibco 公司)，胎牛血清(美国 Gibco 公 司)，胰酶(美国 Sigma 公司)，碘化丙啶(PI)染液 (美国 BD 公司)，Matrigel 胶(美国 BD 公司)，磷酸盐 (PBS)溶液(武汉赛维尔生物科技有限公司)，流式细胞 仪(美国 BD 公司，型号：FACSCanto)，二氧化碳(CO2 ) 培养箱(深圳市瑞沃德公司，型号：CIB-191C)，台式低 速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司，型号：L 500)， 倒置荧光显微镜(广州微域光学仪器有限公司，型号： WSF-1600 )。
1.2原代细胞培养 牙周膜组织标本来源于口腔科，选 取 2019 年 12 月广州医科大学附属惠州医院接受正畸治疗 需拔出的前磨牙的 5 名志愿者。纳入标准：①年龄≥ 18 岁;②牙周健康，无龋齿、牙体缺损或牙髓疾病;③无 基础病史，近 3个月内未服用过激素或影响血糖的药物; ④对研究知情并签署知情同意书。患牙拔出后用含有双抗 的 PBS 缓冲液反复冲洗，在无菌条件下锐性刮取牙根中 部 1/3 处牙周膜组织。将获取的牙周膜组织标本用含庆大 霉素 PBS 液反复冲洗，然后剪成 1 mm3 大小的组织块铺 于细胞培养皿中，加入含有 10% 胎牛血清、200 U/mL 庆 大霉素、100 U/mL 青霉素的 DMEM 培养液 3 mL，置于 CO2 孵箱中 37 ℃ 下培养，每 3 d 换液 1 次，待细胞生长 至 80% 时，加入胰蛋白酶消化并传代培养。取第 4 代细 胞做细胞爬片，通过二氨基联苯胺(DAB)染色观察细胞 形态学结构，鉴定细胞。
1.3细胞分组 取第 5 代牙周膜成纤维细胞进行实验观 察，以 2 × 103 个 / 孔的细胞密度进行接种。根据培养液 成分分组：低糖对照组(含 5.5 mmol/L 葡萄糖的 DMEM 培养基)、高糖组(含 25 mmol/L 葡萄糖的 DMEM 培 养基)、低糖给药组(1 × 10-7 mmol/L 的利拉鲁肽 + 含5.5 mmol/L 葡萄糖的 DMEM 培养基)和高糖给药组 ( 1 × 10-7 mmol/L 的利拉鲁肽 + 含 25 mmol/L 葡萄糖的 DMEM 培养基)。
1.4流式细胞仪检测 取 1.3 中各组培养 72 h 的牙周膜 成纤维细胞，采用胰蛋白酶消化，PBS 漂洗 2 遍，离心弃 上清。加入 100 μL 标记溶液重悬细胞，避光孵育 15 min， 离心收集细胞，PBS 洗涤 1 次。加入 AnnexinV 和 PI 在 37 ℃ 下避光染色 15 min，然后上机检测细胞凋亡率。
1.5 Westerrn-blot检测 取 1.3 中各组培养 72 h 的牙周 膜成纤维细胞，提取全蛋白，按照 BCA 蛋白定量试剂盒 测定蛋白浓度。上样 50 mg 蛋白进行电泳分离，然后转 至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，再加入 B 细胞淋巴瘤 -2 基因(Bcl-2 )、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)抗体，4 ℃ 孵育 过夜，TBST 漂洗 3 次，加入羊抗兔二抗，常温孵育 2 h， TBST 漂洗 3 次，然后在 Tanon 600 图像分析系统中显色 分析。
1.6酶联免疫吸附法检测细胞炎症因子 收集 1.3 中各组 培养 24、48、72 h 时的细胞上清液，取 500 μL 置于洁净 EP 管中。采用酶联免疫吸附法测定细胞上清液中肿瘤坏死因 子 - α(TNF-α )、白细胞介素 -1β(IL-1β)、白细胞介素 -6 (IL-6 )、C- 反应蛋白(CRP)水平。
1.7统计学方法 采用 SPSS 21.0 统计学软件分析数据， 计量资料经 S-W 法检验证实符合正态分布，以 (x ±s) 表 示，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用 LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1人牙周膜成纤维细胞形态与鉴定 培养 8~10 d 后， 人牙周膜成纤维细胞脱离组织块向外延伸，细胞呈星形或 长梭形，交织成为网状;随着培养时间延长，细胞以组织 块为中心放射状生长，约 3 周后，细胞长满培养皿内壁， 密度明显增加，长梭形细胞比例升高，少数呈不规则星 形。免疫组化检测可见波形蛋白染色阳性，细胞角蛋白染 色阴性，说明该细胞来源于中胚层间充质细胞，与实验要 求一致，见图 1.
2.2细胞凋亡率 低糖对照组、低糖给药组、高糖对 照组和高糖给药组细胞凋亡率分别为(4.97±0.15 )%、 (3.07±0.12 )%、( 11.33±1.10 )%、(5.87±0.49 )%。与低糖 对照组比，高糖对照组细胞凋亡率显著升高;且低、高糖 给药组凋亡率显著低于低、高糖对照组，差异均有统计学 意义(均P<0.05)，见图 2.
2.3各组 PDLF中 Bax、Bcl-2蛋白表达情况 低糖对照 组的 Bax 蛋白相对表达量低于高糖对照组，Bcl-2 蛋白相对 表达量高于高糖对照组;低、高糖给药组 PDLF 中 Bax 蛋 白相对表达量分别低于低、高糖对照组，且低糖给药组均 低于高糖给药组;Bcl-2 蛋白相对表达量分别高于低、高糖 对照组，且低糖给药组均高于高糖给药组，差异均有统计 学意义(均P<0.05)，见图 3、表 1.
2.4各组细胞培养液中炎症因子表达 低糖对照组细胞 中 TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP 水平低于高糖对照组;低、高糖给药组细胞中炎症因子水平分别低于低、高糖对照组， 且低糖给药组低于高糖给药组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，见表 2.
3 讨论
PDLF 是一种牙周组织中最具代表性的细胞，能够促 进胶原纤维、胞外基质的合成，参与牙周组织的病变、修 复及再生过程。糖尿病性牙周病变的发病机制复杂，本研 究从 PDLF 凋亡角度出发，分析不同环境下 PDLF 的生理 学活性，为糖尿病合并牙周病变的预防和治疗提供理论依 据。本研究结果显示， 与低糖对照组比， 高糖对照组 PDLF 凋亡率显著升高，提示高糖环境促进细胞的凋亡，从而促 进牙周疾病的发生及发展。究其原因，在高糖环境下，细 胞会产生过多的细胞内活性氧，能够诱导脂质过氧化，引 发细胞膜完整性丧失，线粒体膜去极化，凋亡信号通路激 活，最终导致细胞凋亡。
Bcl-2 基因是目前已知的与细胞凋亡存在密切关系的 重要基因，Bax 与 Bcl-2 蛋白共同参与细胞凋亡的调节过 程。 Bcl-2 是一种原癌基因，能在不影响细胞增殖的前提 下延长细胞凋亡时间，发挥抗细胞凋亡的作用。Bax 则属 于促凋亡因子，通过抑制 Bcl-2 活性，促进细胞的凋亡。 Bcl-2/Bax 比值与细胞凋亡速率有关， 其比值升高说明细胞凋亡减弱， 而Bcl-2/Bax 比值下降则表示细胞凋亡增强 [5] 。 本研究中， 高糖对照组细胞培养 48 h 后 Bax 蛋白相对表达 量高于低糖对照组，Bcl-2 蛋白相对表达量低于低糖对照组，说明高糖环境下 PDLF凋亡速度更快;而高糖给药组 细胞 Bax 蛋白相对表达量低于低糖对照组，Bcl-2 蛋白相 对表达量高于高糖对照组， 提示利拉鲁肽能调节 Bcl-2/Bax 的表达，抑制 PDLF 凋亡，促进牙周疾病的恢复。究其原 因，利拉鲁肽属于胰高血糖素样肽类似物， 通过与组织/ 细 胞上胰高血糖素样肽受体结合，刺激胰岛素的分泌，降低 血糖水平;另外，高糖环境下细胞活力、活性氧活性均降 低，而利拉鲁肽能够降低高糖诱导的肾小管上皮细胞的凋 亡，促进细胞活力，浓度越高，作用效果越明显 [6]。
糖尿病与牙周疾病属于双相促进关系，且均以炎症反 应为桥梁[7]。糖尿病患者机体处于亚临床炎症状态，TNF-α、 IL-1β、IL-6、CRP 等炎症因子表达升高， 导致牙周组织出现 炎症反应，加快牙槽骨及周围软组织病变，限制牙周组织的 修复，逐渐发展成为牙周疾病[8] ;另外，牙周疾病也会介导 局部炎症反应，炎症因子可通过血液循环到达远隔部位，激 发全身性炎症反应， 影响胰岛细胞功能， 造成代谢紊乱， 从 而加重糖尿病病情[9]。有研究表明，糖尿病合并牙周疾病患 者牙周组织中 IL-1β、IL-6 等炎症介质释放显著增加 [10]，因 此抑制炎症反应对糖尿病及牙周疾病的治疗至关重要。本 研究中， 高糖对照组细胞培养液中炎症因子TNF-α、IL-1β、 IL-6、CRP 水平均显著高于低糖对照组，证实高糖环境能诱 导牙周细胞发生炎症反应，从而促进牙周疾患的发生及发 展。另外， 本研究发现， 高糖给药组细胞培养液中 TNF-α、 IL-1β 、IL-6、CRP 水平均低于高糖对照组， 说明利拉鲁肽 能降低糖尿病牙周微环境的炎症反应，抑制炎症因子的释 放，减轻局部炎症对牙周组织的破坏。分析原因可能为， 利拉鲁肽的干预能够明显抑制高糖所诱导的炎症单核细胞 亚群分化，且可减少炎症单核细胞内活性氧的生成，从而 抑制炎症反应 [11]。
综上， 利拉鲁肽能通过降低炎症反应和调节Bcl-2/Bax 的表达，抑制高糖环境下 PDLF 凋亡，促进牙周健康，为 糖尿病合并牙周疾病的治疗提供理论依据，这可能是一种 潜在的延缓糖尿病患者并发牙周疾病的防治策略。
参考文献
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