双氢青蒿素通过激活活性氧的产生诱导急性髓系白血病细胞凋亡论文

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摘要：目的研究双氢青蒿素诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用机制。方法采用MTT试验检测双氢青蒿素对细胞增殖的影响；采用MTT试验、流式细胞术、免疫印迹技术、免疫荧光技术检测双氢青蒿素对细胞凋亡、细胞内ROS水平以及ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对双氢青蒿素诱导细胞凋亡的干扰作用。结果双氢青蒿素呈时间和剂量依赖性抑制急性髓系白血病细胞的增殖；双氢青蒿素连续处理12 h后可诱导急性髓系白血病细胞ROS水平的增加以及凋亡增加；NAC预处理1 h后可提高急性髓系白血病细胞的生存率，同时抑制双氢青蒿素诱导的ROS的增加和细胞凋亡。结论双氢青蒿素诱导急性髓系白血病细胞的凋亡，其作用机制可能与双氢青蒿素的氧化损伤相关。

关键词：双氢青蒿素；ROS；活性氧清除剂；凋亡

本文引用格式：余醒醒,王鑫,周怡,等.双氢青蒿素通过激活活性氧的产生诱导急性髓系白血病细胞凋亡[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(32):112-113.

0 引言

        急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，其化疗是主要的治疗方法。近年来，天然的植物化学药物成为抗肿瘤研究的热点。青蒿素是从中国传统中药青蒿中分离得到的一种半萜内酯。双氢青蒿素（DHA）是青蒿素的主要活性代谢物，被用于治疗疟疾，比青蒿素更有效。本实验主要研究双氢青蒿素对人急性髓系白血病细胞凋亡的促进作用，探讨双氢青蒿素的促凋亡作用与活性氧（ROS）的关系，进一步阐述其对急性髓系白血病细胞的作用机制，为临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂和仪器。

        急性髓系白血病细胞株获自中国科学院细胞库；RPMI-1640培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（Gibco）；双氢青蒿素（Sigma，美国）；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-l-cysteine，NAC）（Beyotime，中国）；CCK-8检测试剂盒（Beyotime，中国）；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（liankebio，中国）；流式细胞仪（ACEA NovoCyte，美国）；共聚焦激光扫描显微镜（Leica，德国）。

1.2 实验方法

        1.2.1 细胞培养：急性髓系白血病细胞株HL-60接种于含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养基中，置于通入5%CO2、37℃的恒温培养箱中培养，细胞悬浮生长，常规换液、传代培养。

        1.2.2 细胞活力检测：将急性髓系白血病细胞株HL-60以3万个/孔的密度接种于96孔板中，加入不同终浓度（0、25、50、100μm）的双氢青蒿素，或加入终浓度为51 mm NAC预处理1小时后在加入双氢青蒿素，在培养箱内孵育12小时后，向每孔加入10μL的cck8溶液，将培养板在培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

        1.2.3 凋亡的检测：将急性髓系白血病细胞株HL-60以150万个细胞/孔的密度接种于6孔板内，加入不同终浓度（0、25、50、100μM）双氢青蒿素，或加入终浓度为51 mm NAC预处理1小时后在加入二氢青蒿素，在培养箱内孵育12小时后收集细胞，用预冷的PBS离心洗涤两次，弃上清。加入500μL预冷的1×Binding Buffer重悬，分别加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI，室温避光孵育5分钟，立即用流式细胞仪检测[1]。

        1.2.4 ROS的检测：细胞经过处理后，收集细胞，用无血清的RPMI-1640培养基洗涤一次，重悬，加入终浓度为4μM的DCFH-DA染色液，37℃孵育30分钟，无血清RPMI-1640培养基洗涤两次，立即用流式细胞仪检测。

        1.2.5 免疫印迹实验：细胞经过处理后，收集细胞，预冷的PBS洗涤1次，加入适量的RIPA裂解细胞，14000 rpm/min 4℃离心10分钟，取上清。使用BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量，从每个样品中取大约10μg的总蛋白，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电泳后将蛋白转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1小时，加入一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜。用TBST洗涤三次，每次５分钟，加入HRP标记的二抗，室温在摇床上缓慢摇动孵育１小时，TBST洗涤3次，每次5分钟。使用化学发光液显色，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，用Image J进行灰度值分析。

       1.2.6 免疫细胞化学：由于Hoechst 33258染料可以与活细胞中的DNA结合，因此它被用来评估细胞核形态的变化。多聚赖氨酸0.2 mg/mL处理细胞爬片12 h，同时将HL-60以150万个细胞/孔的密度接种于6孔板中，分为对照组和加药组，加入终浓度为10μm的DHA，处理12h后收集细胞，用少许培养基重悬细胞，滴加爬片上37℃孵育2小时，再用4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟，1%Tritonx-100打孔5分钟，用5%BSA封闭1小时后，滴加抗体Caspase 3（1:200），4℃过夜，PBS洗涤3次，每次5分钟，滴加二抗FITC-标记山羊抗兔IgG（1:500），室温孵育1小时，PBS洗涤3次，每次5分钟，Hoechst 33258染料（10μg/mL）37℃避光孵育5分钟，PBS洗涤3次后封片，通过共聚焦激光扫描显微镜观察并拍照。

        1.2.7 统计学分析：实验至少重复3次，采用SPSS软件对实验数据进行分析，数据以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVE）。P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 双氢青蒿素诱导ROS的生成。

       流式细胞检测结果显示，双氢青蒿素能显著抑制急性髓系白血病细胞ROS的生成，活性氧清除剂NAC能明显抑制ROS的生成。

2.3 双氢青蒿素诱导急性髓系白血病细胞的凋亡流式细胞检测结果与对照组相比

        双氢青蒿素诱导的急性髓系白血病细胞凋亡率显著增加，活性氧清除剂NAC可减少双氢青蒿素诱导的细胞凋亡。采用免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示双氢青蒿素上调促凋亡相关蛋白（caspase-3，PARP，Bad，Bax）的表达，下调了抑制凋亡蛋白Bcl2的表达。

2.4 免疫细胞组织化学检测双氢青蒿素对AML细胞凋亡的影响。

         通过免疫细胞化学检测核形态及荧光强度的变化，结果显示，与对照组相比，双氢青蒿素可诱导急性髓系白血病细胞的凋亡。Hoechst 33258染色液可穿过细胞膜与细胞核结合，细胞凋亡时，Caspase3被激活，表现为强红色荧光。综上所述，这些结果表明双氢青蒿素可诱导急性髓系白血病细胞ROS的生成，从而诱导急性髓系白血病细胞的凋亡。

3 讨论

         急性髓系白血病（AML）是一种异质性血液学恶性肿瘤。青蒿素作为一种有效的抗疟药物，在过去几十年中被广泛使用。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin）是青蒿素的一种半合成衍生物，研究发现DHA可以通过多种信号通路抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。而且DHA能显著增加T细胞淋巴瘤细胞内ROS的生成，导致细胞周期阻滞和凋亡。通过MTT实验，我们发现双氢青蒿素呈时间依赖性和剂量依赖性抑制急性髓系白血病细胞的增殖，ROS清除剂NAC可减少双氢青蒿素的抑制作用。通过流式细胞检测技术，发现双氢青蒿素诱导急性髓系白血病细胞的凋亡，NAC抑制急性髓系白血病细胞的凋亡，尤其对早期凋亡抑制作用更加明显。因此，我们认为双氢青蒿素通过诱导急性髓系白血病细胞ROS的产生促进细胞凋亡。

       由于ROS可诱导细胞凋亡，因此ROS的产生是大多数化疗药物共有的一种机制。因此ROS也被认为是肿瘤抑制因子，成为抗肿瘤治疗的靶点。在本实验中，双氢青蒿素也能诱导急性髓系细胞产生ROS，为深入的机制研究及临床应用提供了实验基础。

参考文献

[1] 陈伟,王玲,杜苑苑,等.双氢青蒿素人对急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的诱导作用[J].广东医学,2011,32(13):1641-1643.
[2] 谢红,靳秋月,陈立军,等.双氢青蒿素对人白血病细胞K562增殖及凋亡的影响[J].现代生物医学进展,2007,7(11):1671-1673.


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