摘要：建立一种气相色谱法用于定量检测透明质酸钠含量，有效实现产品质量控制。含透明质酸钠的产品经氢氧化钠溶液降解后生成醋酸钠，使用气相色谱仪将醋酸钠在线衍生为醋酸钠衍生物。利用毛细管色谱柱对其进行分离，记录醋酸钠衍生物的峰面积。根据对照品醋酸钠的含量换算得到透明质酸钠含量。醋酸钠质量浓度在0~200μg/mL范围内线性关系良好（r>0.99），中间精密度以及准确度不超过5%，回收率在90%~120%之间。本方法可应用于测试透明质酸钠凝胶或溶液产品中的透明质酸钠含量。
关键词：气相色谱法,透明质酸钠,含量测定
透明质酸钠的双糖重复结构单元由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-（1-3）糖苷键连接而成，每个双糖单元通过β-（1-4）糖苷键与另一个双糖单元连接起来。透明质酸钠广泛应用于外科、化妆品、医疗美容、食品等领域。
透明质酸钠含量测定方法有硫酸咔唑法、液相色谱法和凝胶色谱法。硫酸咔唑法易受其他成分干扰，理论上和咔唑发生反应的物质、含有糖醛酸结构或降解产物中含有糖醛酸结构的物质、降解产物有颜色或经四硼酸钠硫酸反应后生成有颜色的物质等均会影响测试结果。高效液相色谱法[1]利用微生物源（如链球菌属来源的透明质酸酶，EC号为4.2.2.1[2]，费用相对较高）的透明质酸酶裂解透明质酸钠分子中的β-1，4糖苷键得到不饱和低聚糖[3]，对不饱和双键进行定量换算得出透明质酸钠含量。凝胶色谱法以透明质酸钠标准品的峰面积对浓度进行线性回归，计算得到透明质酸钠含量[4]，此方法一方面有相对分子质量范围要求，另一方面依赖于透明质酸钠标准品的相对分子质量。
本文利用透明质酸钠在碱性条件下降解生成醋酸钠[5]，醋酸钠在硫酸乙醇存在条件下经过加热生成醋酸钠衍生物。以醋酸钠作为对照品，使用气相色谱仪将其在线衍生为醋酸钠衍生物，通过醋酸钠含量换算得到透明质酸钠的含量。
1实验部分
1.1仪器与试剂
Agilent 7890B型气相色谱仪（带顶空进样器，配FID检测器）；Tracel 300气相色谱仪（带顶空进样器，配FID检测器）等。
醋酸钠标准品，纯度99.8%；透明质酸钠溶液（透明质酸钠理论质量浓度10 mg/mL）、交联透明质酸钠凝胶（透明质酸钠理论质量浓度15 mg/mL）、含微球的交联透明质酸钠凝胶（透明质酸钠理论质量浓度15 mg/mL），自制；硫酸、盐酸、咔唑、氢氧化钠、氯化钠，为分析纯；乙醇为色谱级。
1.2仪器工作条件
用DB-624色谱柱（30 m×0.53 mm×3μm）或其他效能相当者；初温40℃,维持5 min，以30℃/min升温至220℃,维持5 min；FID检测器，检测室温度250℃;气化室温度为200℃;顶空方式进样，平衡温度55℃,平衡时间90 min。
1.3实验方法
1.3.1硫酸乙醇溶液
取硫酸15 mL，缓慢加入至85 mL乙醇中，边加边搅拌，混匀，备用。
1.3.2供试品溶液
称取供试品适量，置于适宜大小非玻璃材质的试管中，加入氢氧化钠溶液，沸水浴煮沸适量时间后，取出放冷后加入盐酸溶液中和，转移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混合均匀后得到供试品溶液。
1.3.3标准曲线溶液
称取醋酸钠标准品适量，用一定浓度的氯化钠溶液（氯化钠溶液的摩尔浓度与供试品溶液制备过程中氢氧化钠溶液的最终摩尔浓度一致）配制0~200μg/mL的醋酸钠标准溶液，作为标准工作液。
1.3.4空白溶液
称取空白样品（不含透明质酸钠。其中，透明质酸钠溶液对应的空白样品为不含透明质酸钠的渗透压调节溶液；交联透明质酸钠凝胶对应的空白样品为含有BDDE的渗透压调节溶液；含微球的交联透明质酸钠凝胶对应的空白样品为含BDDE及微球的渗透压调节溶液。上述空白样品中BDDE含量为交联透明质酸钠凝胶中BDDE投料量，微球含量与相对应产品中微球含量相同，渗透压调节溶液与相对应产品中渗透压调节溶液一致）适量，按照1.3.2中制备方法制备，得到空白溶液。
1.3.5检测与结果计算
精密量取标准曲线溶液和供试品溶液各1.0 mL置顶空瓶中，分别加入硫酸乙醇溶液1.0 mL，摇匀，密封，顶空进样，记录色谱图。以标准曲线溶液质量浓度(ρ)对峰面积（A）进行线性回归，得标准曲线，标准曲线的线性系数r应不低于0.99；根据供试品溶液的峰面积从标准曲线上计算出供试品溶液中醋酸钠的浓度，并按式（1）计算本品中透明质酸钠的质量浓度（mg/mL）：
式中：ρ为标准曲线上计算得出的醋酸钠的质量浓度，μg/mL；V为供试品稀释后体积，mL；m为供试品的取样质量，g；d为供试品的相对密度；4.892 1为透明质酸钠双糖结构单元分子量（401.3）与产生的醋酸钠分子量（82.03）的比值。
2结果与分析
2.1降解条件确定
考察了碱液浓度以及降解时间对透明质酸钠含量测试结果的影响，其中碱液浓度分别设置为2、4、6 mol/L，降解时间分别设置为30、60、90、120 min。按照1.2的色谱方法测试不同降解条件下产品中透明质酸钠含量。对于透明质酸钠溶液，碱液浓度为4~6 mol/L，降解时间至少30 min测得的透明质酸钠含量均在95%以上即透明质酸钠降解完全；对于交联透明质酸钠凝胶以及含微球的交联透明质酸钠凝胶，碱液浓度为4~6 mol/L，降解时间至少60 min测得的透明质酸钠含量均在95%以上即透明质酸钠降解完全。
2.2专属性结果
考虑到透明质酸钠在交联过程中并没有破坏其分子结构中的乙酰基，因此无论是透明质酸钠溶液、交联透明质酸钠凝胶还是含微球的交联透明质酸钠凝胶，其在碱性条件下均能够降解生成醋酸钠，故专属性仅以透明质酸钠溶液为例进行考察。将供试品（透明质酸钠溶液）溶液、空白溶液、对照品溶液、加标供试品溶液按照1.2的色谱条件进样分析，结果如图1所示。在目标峰出峰位置，空白溶液无检出，供试品溶液、加标供试品溶液以及对照溶液均有目标峰检出，且峰型良好，邻近无杂峰，提示专属性良好。
2.3线性与范围结果
醋酸钠质量浓度为0~200μg/mL范围内设置至少5个不同浓度的标准曲线溶液来考察线性，以响应值对相应浓度进行线性回归，线性回归方程为y=0.130 1x-0.160 7，相关系数r=0.999 6，提示线性关系良好。
2.4中间精密度结果
不同人员在不同日期对同一批供试品（透明质酸钠溶液）使用不同仪器进行透明质酸钠含量测试，人员1使用Tracel 300气相色谱仪测得的6份供试品中透明质酸钠质量分数分别为95.6%、96.2%、97.1%、96.1%、97.3%、94.9%，平均值为96.2%，RSD为0.9%；人员2在不同时间使用Agilent 7890B型气相色谱仪测得的6份供试品中透明质酸钠质量分数分别为94.6%、98.7%、98.9%、103.2%、97.7%、107.0%，平均值为100.0%，RSD为4.4%；12份供试品中透明质酸钠的平均质量分数为98.1%，RSD为3.7%，提示本方法的中间精密度良好。
2.5准确度结果
准确度考察通过加样回收实验的方式开展，即在透明质酸钠溶液产品对应的空白样品中加入标准物质，平行制备6份样品，按照1.2的色谱条件进行测试，6份加标供试品的回收率为94.5%、97.7%、98.1%、98.4%、95.6%和96.3%，平均回收率为96.8%，相对标准偏差为1.6%。
2.6方法的准确性结果
选择同批次生产的透明质酸钠溶液按照硫酸咔唑法进行测试将其测试结果与本方法的结果进行比较。本方法测试的6份供试品中质量分数分别为95.6%、96.2%、97.1%、96.1%、97.3%及94.9%；而使用硫酸咔唑法测试的6份供试品中透明质酸钠质量分数分别为95.6%、94.3%、98.4%、96.7%、97.7%及98.2%。使用双样本t检验进行分析，t值为0.82小于t0.05（给定α=0.05自由度为10，查询t分布表得t0.05=2.63）说明两种测试方法无统计学差异进一步证明此方法准确可靠。
2.7耐用性
2.7.1溶液稳定性考察
考虑到一般色谱检测过程中有序列进样的情况，需要确定对照品溶液、供试品溶液在常规条件（室温）下至少24 h内稳定，因而分别取供试品（透明质酸钠溶液）溶液和80μg/mL的对照溶液1.0 mL，置20 mL顶空瓶中，加硫酸乙醇溶液1.0 mL，摇匀，密封，平行制备2组，分别在0h和24h按照1.2的色谱条件检测，结果显示两个时间点测得供试品溶液和对照品溶液峰面积的比值（Ax/As）的相对偏差（RAD）为4.5%，提示供试品溶液在24h内稳定。
2.7.2色谱条件耐用性考察
色谱条件耐用性主要考察色谱柱之间的差异，使用不同厂牌/批号色谱柱（色谱柱1：TG-624silMS，色谱柱2：BD-624）；初始柱温的变化，初始柱温变化38~42℃（色谱柱2）；顶空平衡温度变化，顶空平衡温度变化50~60℃（色谱柱2）；平衡时间的变化，平衡时间变化80~100 min（色谱柱2）。上述不同色谱条件下透明质酸钠溶液（供试品）中透明质酸钠质量分数检测结果见表1，各色谱条件下透明质酸钠溶液中透明质酸钠质量分数均在90%~100%之间，RSD值均不超过5%，提示本方法对该色谱条件的微小变动耐用。
2.8方法适用性结果
为了考察其对于交联透明质酸钠凝胶类产品的适用性，配制了交联透明质酸钠凝胶和含微球的交联透明质酸钠凝胶对应的供试品溶液。测试其回收率即分别向两种产品对应的空白样品中加入透明质酸钠，测试其回收率，结果表明交联透明质酸钠凝胶和含微球的交联透明质酸钠凝胶产品的回收率分别为99.0%和99.8%，RSD分别为2.3%和2.2%，且使用该方法测试的透明质酸钠平均质量分数分别为100.7%、102.6%，RSD均不超过5%，提示本方法同样可用于检测交联透明质酸钠凝胶产品中的透明质酸钠含量。硫酸咔唑是经典的测试透明质酸钠含量的方法，2.6的结果表明对于不含干扰物质的产品，此方法与硫酸咔唑法测得的透明质酸钠含量无显著性差异。为了进一步研究含干扰物质的产品对此方法的适用性，以干扰物质乳酸为例（聚乳酸微球在降解过程中会产生乳酸）进行研究，乳酸经四硼酸钠硫酸反应后生成黄色溶液，干扰葡萄糖醛酸与咔唑的显色反应，进而影响产品中透明质酸钠含量测试结果。这里向透明质酸钠溶液中加入4 mg/mL的乳酸，分别使用硫酸咔唑法和本文中的方法进行测试。使用硫酸咔唑法测试6份供试品中透明质酸钠质量分数分别为59.8%、55.4%、56.7%、58.2%、57.2%以及58.9%；而使用本方法测试的6份供试品中透明质酸钠质量分数为97.6%、98.4%、95.2%、99.3%、96.3%、96.9%。提示4 mg/mL的乳酸会干扰硫酸咔唑法测试透明质酸钠含量，但不干扰本方法检测透明质酸钠含量。再次说明此方法的提出为透明质酸钠类产品中透明质酸钠含量的检测提供了一种新方法，具有一定的推广价值。
3讨论与结论
本工作在碱性条件下将透明质酸钠降解生成醋酸钠，使用气相色谱仪将醋酸钠在线衍生为醋酸钠衍生物，以醋酸钠为对照品，利用气相色谱仪测试醋酸钠衍生物的含量，通过醋酸钠含量换算得到透明质酸钠的含量，通过考察本方法的专属性、线性与范围、中间精密度、准确度、耐用性显示本方法适用于透明质酸钠溶液产品中透明质酸钠含量检测。另外，使用本方法分别检测交联透明质酸钠凝胶以及含微球的交联透明质酸钠凝胶产品中透明质酸钠含量，提示本方法同样适用于交联透明质酸钠凝胶产品中透明质酸钠含量测试。对于硫酸咔唑法不适用的部分产品，此方法同样适用，说明本方法具有一定的推广价值，当然此方法也有一定的局限性，如带有乙酰基的物质可能会干扰检测结果。
参考文献
[1]陈玉娟，陈雯雯，乔莉苹，等.高效液相色谱法测定透明质酸钠含量的研究[J].药学研究，2020，39（3）：146-148.
[2]雷曦，张蕊，黄遵锡，等.透明质酸酶的研究进展[J].微生物学通报，2021，48（3）：882-895.
[3]Wang L,Liu Q,Gong X,et al.Cloning and biochemical characterization of a hyaluronate lyase from bacillus sp.CQMU-D[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2023,33(2):235-241.
[4]董科云，栾贻宏，郭学平.凝胶色谱法测定透明质酸钠的含量[C]//山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集.山东：山东省药学会生化与生物技术药物专业委员会，2006：3.
[5]贺芸.透明质酸的降解研究[D].江苏：南京理工大学，2010.
文章出自SCI论文网转载请注明出处：https://www.lunwensci.com/ligonglunwen/81599.html
