TNF-α对哮喘小鼠肺组织表达TNF-αR、CysLTR1的影响论文

SCI论文（www.lunwensci.com）:

摘要：目的用不同方式及剂量的TNF-α干预哮喘小鼠，研究其肺组织TNF-α受体（TNF-αR）、CysLTs受体1(Cysteinyl leukotriene receptor 1,CysLTR1)的表达。方法48只小鼠分为正常对照组（A组）、哮喘非干预组（B组）、TNF-α低剂量腹腔给药组（C1组），高剂量腹腔给药组（C2组），TNF-α低剂量雾化组（D1组），高剂量雾化组（D2组）。分别采用免疫组化法（IHC）检测TNF-αR，WB检测肺组织中CysLTR1表达情况。结果（1）IHC测TNF-αR阳性细胞计数分别为：20.1079±1.115、25.832±3.240、38.324±5.102、53.366±5.774、44.037±4.102、55.372±7.536。除C2组和D2组外，其余任意两组间差异均有统计学意义（P<0.05）；（2）WB检测CysLTR1蛋白相对密度分别为0.797±0.081、1.422±0.97、1.784±0.210、2.448±0.096、2.023±0.058、2.933±0.034，除B组和C1组、C2组和D2组外，其余任意两组间差异均有统计学意义（P<0.05）。结论TNF-α使哮喘小鼠肺组织表达TNF-αR、CysLTR1增多，可能使抗TNF-α治疗受益于哮喘治疗。

关键词：哮喘；半胱氨酰白三烯受体1；肿瘤坏死因子-α

本文引用格式：宋晓丹,张世杰,欧维琳,等.TNF-α对哮喘小鼠肺组织表达TNF-αR、CysLTR1的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(42):170-172.

The Effect of Tumor Necrosis Factor Alpha on Expression of TNF-αR、CysLTR1 in Mouse Lung Tissue SONG Xiao-dan#,ZHANG Shi-jie#,OU Wei-lin*,ZHENG Wei-hua,WANG Chang-ying,WANG Dan,ZHANG Si-xuan(The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin Guangxi)

ABSTRACT:Objective To investigate the expression of TNF-αreceptor（TNF-αR）、Cysteinyl leukotriene receptor 1(CysLTR1)in lungs in asthma mice model and to explore the role of TNF-αplayed in asthma pathogenesis.Methods 48 BALB/c mice were randomly assigned into normal control(A group),asthma group(B group),inhaled low dose TNF-αgroup(C1 group)、inhaled high dose TNF-αgroup(C2 group)、injected low dose TNF-αgroup(D1 group)and injected high dose TNF-αgroups(D2 group)(n=8 each).The mice were sensitized with ovalbumin to establish the asthmatic model.Immunohistochemistry(IHC)and western blotting(WB)were performed to detect the expression of TNF-αR、CysLTR1 receptively in all groups.Results(1).IHC TNF-αR positive cells count in different groups as follows:20.1079±1.115、25.832±3.240、38.324±5.102、53.366±5.774、44.037±4.102、55.372±7.536.The difference betweenC2 and D2 had no statistical differences,any differences between the rest of two groups were statistically significant(P<0.05).(2).The relative density of CycLTR1 detected by WB in each group are 0.797±0.081,1.422±0.97,1.784±0.210,2.448±0.096,2.023±0.058,2.933±0.034,The difference between B and C1,C2 and D2 had no statistical difference,any differences between the rest of two groups were statistically significant(P<0.05).Conclusions TNF-αescalates the expression of TNF-αR、CysLTR1 in lung tissue,and that positively related with the dosage of TNF-α,so anti-TNFαwould be a new research direction.

KEY WORDS:Asthma;Cysteinyl leukotriene receptor 1;TNF-α

0引言

       支气管哮喘为多种细胞因子及介质参与，形成气道慢性炎症、气道高反应性甚至气道重塑等。已被研究的细胞因子较多，其中TNF-α和半胱氨酰白三烯（Cysteinyl leukotriene,CysLTs)是参与哮喘发生、发展的重要细胞因子，TNF-α作为一种前细胞炎性因子，可诱导细胞产生一系列细胞因子，从而趋化嗜酸性粒细胞释放CysLTs等炎性介质，引起上皮细胞脱落等改变，促进气道慢性炎症的产生，最近更有研究发现TNF-α与难治性哮喘有关。同时在炎性细胞释放的介质中，CysLTs能促进炎性细胞游走渗出、促进骨髓嗜酸性粒细胞增生，并参与气道重塑等，但CysLTs的生物活性均需与靶细胞膜表面的半胱氨酰白三烯受体1(Cysteinyl leukotriene receptor 1,CysLTR1)结合而完成。本实验观察TNF-α对哮喘小鼠肺组织CysLTR1表达的影响，探讨TNF-α除诱导炎性细胞释放CysLTs外，是否上调细胞表达CysLTR1，从而加剧CysLTs在哮喘气道炎症、气道高反应性以及气道重塑等方面的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组

        SPF级健康雌性Balb/c小鼠48只，4-6周龄,体质量18-25g。随机分为6组：正常对照组（A组）8只，哮喘模型非干预组（B组）8只，哮喘+TNF-α低剂量腹腔注射给药组8只（C1组，0.1g/kg），哮喘+TNF-α高剂量腹腔注射给药组8只（C2组，0.4g/kg，），哮喘+TNF-α低剂量雾化吸入给药组8只（D1组，0.2g/l），哮喘+TNF-α高剂量雾化吸入给药组8只（D2组，0.5g/l）。

1.1.2主要实验试剂

        鸡卵白蛋白（OVA）（美国SIGMA公司，批号：00M7012V），重组人肿瘤坏死因子-α（Novoprotein公司，批号：0328985），高纯总RNA快速提取试剂盒（Generay公司），逆转录试剂盒（Fermentas公司）qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad公司）。

1.2实验方法

1.2.1建立模型

       除A组外，各组小鼠分别于第1天、第8天和第15天腹腔注射20gOVA和10%氢氧化铝凝胶0.2mL致敏，第22天至第28天将小鼠置于封闭容器中，超声雾化吸入2%OVA诱发哮喘，每天一次，每次30min。A组在第1天、第8天和第15天腹腔注射等量生理盐水作为对照，并在第22天至第28天超声雾化吸入等量生理盐水。

1.2.1.1各干预组TNF-α给药方式和给药剂量及给药时间

        实验的22至28天，在2%OVA雾化诱发前，C1、C2组分别给予TNF-α0.1g/kg、0.4g/kg腹腔注射，每天1次；D1、D2组分别给予0.2g/l、0.5g/lTNF-α雾化吸入，每次雾化30min。

1.2.2免疫组织化学法（IHC）检测肺组织TNF-αR阳性细胞表达

       各组小鼠于末次激发后24h内取左肺下叶组织固定包埋,通过免疫组化法检测小鼠肺组织中TNF-αR的表达。胞膜或者胞浆染色为棕黄色为阳性细胞。光镜400倍视野下每个切片随机选择5个高倍视野进行阳性细胞计数，以均数加减标准差代表该组阳性细胞数。

1.2.3WB检测肺组织CysLTR1蛋白相对密度

         取小鼠右肺组织制备蛋白标本后，经WB检测肺组织CysLTR1蛋白表达情况，并测出其相对密度。

1.3统计学方法分析

       应用SPSS 17.0软件，对所有计量资料行正态分布检验，若符合正态分布，以表示，任意2组间均数的比较采用单因素方差分析，方差齐者用LSD检验，不齐者用Dunnett’s T3检验，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1IHC法检测哮喘小鼠肺组织TNF-αR表达

       高倍显微镜下（×400）,观察褐色TNF-αR阳性细胞（TNF-αR+）的数量及分布情况，图7-12。


       上述图片中褐色细胞为肺组织TNF-αR阳性细胞，哮喘组及干预组均较正常组增加明显，主要集中支气管上皮细胞及肺泡细胞周围。其中C组小鼠在所有组TNF-αR1阳性细胞增多最明显。经统计软件检验发现，C2组和D2组之间差异没有统计性，其余任意两组间差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2WB法检测哮喘小鼠肺组织CysLTR1蛋白



         如图13所示，A组、B组、C1组、C2组、D1组和D2组六组条带均可见，WB法检测各组的R1蛋白相对密度分别为0.797±0.081、1.422±0.97、1.784±0.210、2.448±0.096、2.023±0.058、2.933±0.034，统计软件分析B组和C1组之间、C2组和D2组之间CysLTR1蛋白表达无差异，D2组表达明显高于其他组。

3讨论

         TNF-α作为重要的炎症介质，在炎症发生发展中起到重要作用，也被认为是一种前炎症因子，与肿瘤坏死因子受体1、2（TNF-αrecepter1、2，TNF-αR1、2）结合而发挥其生物作用。在哮喘的发病过程中，TNF-α同样参与了气道炎症的产生。Yang等人对16种细胞因子的研究发现其中TNF-α、CXCL8与哮喘病理改变最为密切[1]。由于哮喘患者TNF-αmRNA及蛋白水平明显升高[2]，且吸入TNF-α后气道反应性增加，TNF-α同样也是中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的趋化因子，促进中性粒细胞及嗜酸性粒细胞细胞分泌下游炎症因子，产生因子毒性；并使气道上皮细胞分泌细胞粘附因子-1及血管细胞粘附因子-1，这些上调的粘附因子直接趋化炎性细胞向肺部浸润，尤其在气道慢性炎症的启动及气道高反应性的产生初期均有作用，并且通过TNF-αR1延迟哮喘患者嗜酸性粒细胞凋亡，加重气道嗜酸性粒细胞炎症，甚至有研究发现TNF-α因可改变气道上皮细胞活性而影响气道屏障完整性相关，此外通过调节MAPK激酶等参与调控气道平滑肌细胞收缩，并加重气道平滑肌细胞经乙酰甲胆碱刺激而出现的收缩效应，而气道平滑肌肌束周围的肥大细胞等是TNF-α的重要来源。另外有研究发现，哮喘患者尤其是持续状态患者中，存在高凝状态及纤溶系统受损表现，该状态与IL-6及TNF-α导致的炎症反应相关[3]。

         哮喘患者中有部分对吸入糖皮质激素疗效甚微，有研究发现在美国黑人儿童中难治性哮喘部分与高TNF-α表达有关，这部分人群不仅对哮喘常规治疗无效，且气道反应性升高明显[4]。这种非嗜酸性粒细胞炎症与激素治疗哮喘的不敏感性相关，主要表现为气道中性粒细胞活化与慢性中性粒细胞性炎症。慢性肺部感染、气道微生物菌落改变、中性粒细胞凋亡延迟可能导致病人非嗜酸性粒细胞性炎症、Th2辅助细胞功能低下、气道高反应性、气道重塑等[5]；TNF-α由于对中性粒细胞的募集可能引起平滑肌细胞增殖、刺激纤维原细胞生长、促肌成纤维细胞成熟而参与气道重塑等，被认为与难治性哮喘发病机制有关。气道高反应性是哮喘的特征表现，早期主要由肺组织内肥大细胞释放炎症介质介导IgE途径发生，但研究发现经抗TNF-α预处理后，后期气道高反应的发生可被延迟或明显减缓[6]。此外在致敏阶段给予抗TNF-α微球蛋白处理后，小鼠血浆卵清蛋白特异性IgE水平明显降低，对乙酰甲胆碱引起的气道反应性也减轻，肺泡灌洗液中炎症介质水平降低，气道上皮黏膜细胞化生减少，细胞分泌被抑制[7]。部分观点认为对部分持续高表达TNF-α的儿童，抗TNF-α治疗可能是有益的[8]。此外，随着环境因素的恶化，有研究表明臭氧污染与哮喘气道炎症及气道高反应相关，实验证实臭氧可使嗜酸性粒细胞向肺组织浸润聚集，但该现象可被TNF-α受体拮抗剂阻断[9]。因此，TNF-α与难治性哮喘发生的具体分子机制仍需要更深层次的研究，这对于难治性哮喘抗TNF-α治疗的机制、有效性等研究的展开奠定了基础。

         CysLTs是主要由活化的肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞分泌的炎症介质，包括LTC4，LTD4、LTE4。可引起明显的气道收缩，增加血管通透性，活化嗜酸性粒细胞，使气道上皮分泌增多，在血栓素A2及肺组织前列腺素T受体的参与下，CysLTs通过CysLTR2活化血小板，从而引起嗜酸性粒细胞致敏，并向肺组织聚集[10]，形成嗜酸性粒细胞性炎症[11]，同样也趋化中性粒细胞向肺组织游走，形成及非嗜酸性粒细胞性炎症，并通过G蛋白偶联受体影响上述细胞以及Th2型淋巴细胞、部分中性粒细胞及CD8+细胞，甚至一些结构细胞的自分泌[12]。先天淋巴细胞（innate lymphoid cells,ILC）近来被认为是哮喘早期炎症反应重要的启动因素，实验证实CysLTs1R可促进LTC4分泌，并增加先天淋巴细胞活性，从而参与哮喘肺部炎症的形成[13]。研究证实，在阿司匹林哮喘中CysLTs分泌明显增多，继而通过IL-33活化肥大粒细胞，可能是该种病的病理机制之一[14]。CysLTs中LTC4可致肥大细胞增殖，并释放细胞因子，LTE4因可趋化炎性细胞，促进气道上皮细胞粘液性分泌，推测可能与气道高反应及气道重塑有关[15]。此外有研究报道体外实验中CysLTs可使哮喘患者平滑肌细胞增殖[16]，并通过5-脂氧化酶在体内外试验中均可上调骨髓嗜酸性粒细胞数量[17]。在气道重塑方面，白三烯受体拮抗剂可逆转杯状细胞化生、平滑肌细胞增厚、上皮细胞纤维化等表现，并可抑制气道过敏性疾病中嗜酸性粒细胞向肺部募集[18]。

         目前TNF-α对于TNF-αR、CysLTR表达的影响尚未知，在本实验的前期研究中，已经证实经TNF-α可使CysLTs表达增加，肺组织病理改变较非干预组明显，这表明TNF-α、CysLTs在哮喘发病的病理机制中起到重要作用，这与上述研究在某些方面有共同发现。此外，本实验研究发现，将TNF-α通过不同剂量及不同方式干预小鼠后，TNF-αR、CysLTR1的表达也不同，因此，在部分高表达TNF-α的患者中，TNF-α可能通过该机制参与哮喘的发病，这提示抗TNF-α治疗在这部分患者中可能存在新的治疗机制。

4展望

         支气管哮喘的发病机制仍在不断研究与探索中，尤其对于吸入激素治疗效果不佳的原因探讨尤为迫切，在已报到的研究中发现TNF-α与这部分患者的发病机制有关，这部分激素吸入治疗无效的哮喘患者提供了可能有益的治疗契机，但目前对于抗TNF-α治疗在部分难治性哮喘中的展开仍存有争议。目前部分观点认为抗TNF-α治疗对部分难治性哮喘患者的气道高反应性、肺功能及生活治疗有一定改善[19]，但是可能引起一些不良反应，例如严重感染、致癌性等，故应继续研究，权衡治疗利弊。

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