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摘要：目的探讨热疗对胃癌细胞HSP70和CXCL13、CXCR5基因表达及增殖的影响,进而为胃癌靶向治疗提供新思路。方法用不同温度（37℃、41℃、42℃）处理人胃癌细胞株SGC7901模拟肿瘤热疗，采用细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8试剂盒）检测细胞增殖抑制率；实时荧光定量多聚酶链反应(RT-PCR)检测HSP70、CXCL13、CXCR5 mRNA的表达情况。结果CCK-8结果显示，41℃和42℃胃癌细胞抑制率分别为14.97±1.30%、61.53±0.49%，差异有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR结果显示，随着温度的升高HSP70、CXCL13、CXCR5 mRNA的表达量逐渐降低(P<0.05)。结论热疗可抑制人胃癌细胞的增殖，且42℃作用1h更明显。靶向抑制HSP70和CXCL13、CXCR5的表达，有望成为胃癌药理研究的新方法。
关键词：胃癌；热疗；HSP70；CXCL13；CXCR5
本文引用格式：潘光敏,刘俊衡,代洪生,等.热疗对人胃癌细胞HSP70和CXCL13、CXCR5的影响及其生物学意义[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(78):20-21,23.
Effect of Hyperthermia on the Expression of HSP70,CXCL13,CXCR5 and Its Significance in Human Gastric Cancer Cell
PAN Guang-min1,LIU Jun-heng3,DAI Hong-sheng2,WANG Jin-di1,CHEN Ning1,
SHEN Ting-ting 1,JI Wan-sheng2,GAO Zhi-xing2*,ZHANG Zhao-mei2
(1.Weifang Medical University,Weifang Shandong;2.Affiliated Hospital of Weifang Medical University,Weifang Shandong;3.Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao Shandong)
ABSTRACT:Objective To investigate the effect of hyperthermia on the mRNA expression of HSP70 and CXCL13,CXCR5 as well as the proliferation of gastric cancer cells,so as to provide new ideas for the targeted therapy of gastric cancer.Methods Different temperatures(37℃、41℃、42℃)were applied to human gastric cancer cell line SGC7901 to simulate tumor hyperthermia.The cell proliferation inhibition rate of human gastric cancer cell was tested by Cell proliferation/toxicity testing kit(CCK-8 kit).The mRNA expressions of HSP70、CXCL13、CXCR5 was detected by real-time polymerase chain reaction(RT-PCR).Results CCK-8 assay showed that the inhibitory rates of gastric cancer cells at 41℃and 42℃were 14.97±1.30%,61.53±0.49%,and the difference was statistically significant(P<0.05).RT-PCR showed that the mRNA expression of HSP70、CXCL13、CXCR5 decreased with the increase of temperature(P<0.05).Conclusion Hyperthermia can inhibit the proliferation of human gastric cancer cells,especially at 42℃for 1 h.Targeting inhibition of the expression of HSP70 and CXCL13,CXCR5 is expected to be new methods for pharmacological research of gastric Cancer.
KEY WORDS:Gastric cancer;Hyperthermia;HSP70;CXCL13;CXCR5
0引言
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。胃癌传统疗法包括手术、放化疗等。近年来，肿瘤热疗逐渐被重视，被医学界称为“绿色治疗”。热休克蛋白（heat shock protein70,HSP70）是机体在热应激（或其他应激）时合成增多的一种常见蛋白质。研究发现，HSP70参与了胃癌的发生发展[1]。胃癌转移与CXCL13、CXCR5密切相关[2]。目前关于热疗对CXCL13、CXCR5影响的报道甚少。本研究，通过利用不同温度处理人胃癌细胞，模拟肿瘤热疗环境，观察热干预对胃癌细胞生长增殖状况的影响及HSP70、CXCL13和CXCR5表达变化情况。进而为胃癌靶向治疗提供新思路和实验依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
人胃癌细胞株SGC7901由第四军医大学馈赠。RPMI1640培养液购自Hyclone(AC12557263);胎牛血清为杭州四季青公司；胰蛋白酶及青链霉素混合液均购自索莱宝；CCK-8购自上海翊圣生物科技有限公司（货号40203ES76）；TRIZOL试剂购自康为世纪（批号03877/10138）；Real-time PCR及qPCR试剂盒购自日本东洋纺toyobo；PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
用RPMI-1640完全培养基培养人胃癌细胞,且置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度培养箱中培养。在显微镜下观察细胞生长状况，适时更换新鲜培养基。约72h传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。
1.2.2CCK-8法检测胃癌细胞增殖抑制率
将胃癌细胞按照100L/孔，5×104/mL的密度接种到96孔板中，并在板盖上注明细胞名称、温度分组、接种时间等信息。培养箱中过夜后更换新鲜培养液，对照组置于37℃水浴锅中培养1 h，实验组分别置于41℃和42℃水浴锅中各培养1 h。随后弃旧培养基，加入100L体积分数为10%CCK-8的新鲜完全培养液（避光操作），培养箱孵育2 h，用酶标仪(波长450nm)测各孔吸光度值，取每组的平均值计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=（A对照组-A实验组）（/A对照组-A空白组）×100%。实验重复3次。
1.2.3RT-PCR检测胃癌细胞HSP70、CXCL13、CXCR5 mRNA的表达水平
将胃癌细胞按照2~3×104/mL的密度接种到6孔板中，置于培养箱中过夜贴壁。然后按照分组分别置于37℃、41℃和42℃水浴锅中各培养1h后，用TRIzol提取总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA。GAPDH为内参照，反应体系为20L，PCR反应条件为95℃预变性1min、95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共40个循环。用实时荧光定量PCR仪(美国ABI PRISM7500)对PCR产物进行实时定量分析。引物序列及片段长度见表1。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验数据用（±s）表示，各组数据进行正态检验及方差齐性检验后，采用单因素方差分析，两变量间相关性采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1热疗对人胃癌细胞增殖的影响
CCK8结果显示，不同温度作用于人胃癌细胞1 h后，随着温度的升高，胃癌细胞抑制率分别为14.97±1.30%、61.53±0.49%，差异有统计学意义（P<0.05）。可见，一定程度的热干预可抑制胃癌细胞生长。
2.2热疗对人胃癌细胞HSP70、CXCL13、CXCR5mRNA表达的影响
RT-PCR结果显示，不同温度作用于人胃癌细胞1h后，温度干预对人胃癌细胞HSP70、CXCL13、CXCR5 mRNA的表达有影响（P<0.05），即随着温度的升高HSP70、CXCL13、CXCR5的表达量逐渐降低。HSP70、CXCL13、CXCR5 mRNA的表达量见表2，图1。
2.3胃癌细胞中HSP70与CXCL13、CXCR5mRNA表达相关性
Pearson相关分析结果显示，胃癌细胞中HSP70与CXCL13、CXCR5mRNA的表达均呈正相关(r1=0.980，r2=0.985，P<0.01)。
3讨论
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在消化道肿瘤中居首位[3]。早期胃癌病情隐匿，且缺乏特异性生物标志物，大部分胃癌在确诊时已处于中晚期。胃癌转移已经成为影响胃癌患者疗效的重要因素。目前，治愈早期胃癌的首选方法仍然是手术切除胃癌病灶[4]。全球范围内统计,可切除胃癌患者的5年生存率只有20%-30%[5]。对于晚期胃癌患者，单纯手术治疗效果欠佳，常以放化疗为主。但越来越多的化疗耐药使胃癌患者化疗失败率增加，不能获得良好预后。热疗作为继手术、放化疗、免疫疗法之后的新兴肿瘤治疗手段，受到国际肿瘤界的公认[6]。热疗可清除游离癌细胞、亚临床病灶和微小癌结节，是一种杀死腹腔播散性癌细胞的有效方法[7]。腹腔热灌注化疗，能够使复发或转移晚期腹盆腔恶性肿瘤患者在近期疗效和长期生存率上得到明显提高[8]。但是，热干预对机体来说亦是应激原，对于严重心肺功能不全、严重感染或体内有热积聚金属置入物和起搏器等患者存在诸多禁忌[9-11]。因此，探究特异性的有效抑制胃癌发生发展的分子靶点及其信号通路，能为改善胃癌患者预后提供新思路。
正常状态下，热休克蛋白HSP70作为一种应激诱导的伴侣蛋白，主要定位于细胞核或胞浆中，在机体受到应激时合成增多，可帮助蛋白质折叠、解聚、复性或降解，从而发挥细胞保护作用，增强细胞抗损伤能力。研究证实，HSP70在多种肿瘤中过度表达，且可促进癌细胞的增殖、侵袭和转移[12]。鲁[13]发现，HSP70与胃癌的发生发展相关，可能是胃癌预后不良的重要因素。Sheng[14]发现HSP70与胃癌化疗耐药关系密切，基因敲除HSP70后，可促进顺铂诱导的胃癌细胞凋亡。可见，HSP70在正常细胞中起保护作用，但在胃癌细胞中却促进其进展。
趋化因子是一种小分子的细胞因子家族蛋白，可趋化细胞沿着趋化因子浓度增加的信号，向趋化因子源处迁徙。其中趋化因子CXCL13及其受体CXCR5在多种肿瘤中异常表达，且与肿瘤进展密切相关。CXCL13主要分布于肝脏、胃、血清及淋巴结等，CXCR5主要定位于细胞膜上。Zheng[15]发现，肾透明细胞癌患者组织和血清中的CXCL13水平均高于健康对照组，且与CXCR5显著相关。CXCR5基因敲除后可减弱CXCL13的功能，CXCL13与CXCR5结合则可促进癌细胞增殖迁移与病情进展。在人急性髓系白血病细胞中，CXCR5可促进其配体CXCL13的迁移[16]。在乳腺癌中的研究结果表明，抑制CXCL13能显著降低细胞增殖，提高细胞凋亡率[17]。Meng[1]在胃癌的研究中发现，胃癌患者CXCL13浓度高于健康者，且与胃癌淋巴转移、胃癌进展有关。CXCL13高表达与胃癌肿瘤大小，生存期缩短有关[18]。亓[19]进一步证实，胃癌组织中CXCL13及CXCR5表达明显高于癌旁组织，且胃癌组织中CXCL13的表达与淋巴结转移相关。因此，靶向抑制CXCL13、CXCR5，这对胃癌患者，特别是晚期伴淋巴结转移的患者，是一种值得探索的新方法。
本次研究发现，与对照组37℃相比，41℃和42℃模拟的肿瘤热疗可使人胃癌细胞的生长受到明显的抑制。随着温度的升高，HSP70、CXCL13、CXCR5 mRNA的表达量也逐渐降低。且在42℃作用1h效果更明显。Pearson相关分析显示，HSP70与CXCL13、CXCR5mRNA的表达均呈正相关。根据以上结果推测，热疗可能通过干扰HSP70与CXCL13、CXCR5的表达抑制了人胃癌细胞的增殖。且HSP70与CXCL13、CXCR5之间可能存在关联作用，三者共同在胃癌细胞的增殖或凋亡中发挥效果。
综上所述，HSP70、CXCL13、CXCR5参与了胃癌发生、发展及转移，一定程度热疗可抑制胃癌细胞增殖及HSP70、CXCL13、CXCR5的表达。靶向抑制HSP70或CXCL13、CXCR5的表达，有望成为胃癌药理研究的新方法。特别是对于不能耐受热疗或存在热疗禁忌症的患者，是值得我们思考和探索的研究方向。然而本实验中，目前尚不清楚热疗是如何降低HSP70及CXCL13、CXCR5的表达，还待进一步研究，探究其作用机制可为胃癌治疗提供新策略。
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