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摘要：总结目前现有的类风湿性关节炎的实验动物模型，为类风湿性关节炎相关动物实验提供建模参考。文章对近十几年来国内外相关文献对关节炎模型的报道进行整理、分析与归纳。目前最为常用的关节炎动物模型为佐剂诱导型和胶原诱导型，其他模型有卵蛋白诱导型，蛋白多糖诱导型，软骨低聚体基质蛋白诱导型，以及自发性基因修饰关节炎模型。类风湿性关节炎的建模方法有很多种，各有利弊，需要结合自己实验的实际情况选择合适的实验动物模型。
关键词：类风湿性关节炎；实验动物模型；研究进展
本文引用格式：谢小倩,万志杰,武小晗,等.类风湿性关节炎实验动物模型研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(80):118-119.
Experimental Animal Model of Rheumatoid Arthritis
XIE Xiao-qian,WAN Zhi-jie,WU Xiao-han,WANG Ya-le,LUO Sha-sha,LI Xiao-tian*
(School of Pharmaceutical Sciences,Zhengzhou University,100 Kexue Avenue,Zhengzhou Henan)
ABSTRACT:To summarize the current experimental animal models of rheumatoid arthritis,and provide a reference for modeling rheumatoid arthritis.Summary the related literature of rheumatoid arthritis experimental animal models.The most commonly used animal models of arthritis are adjuvant-induced and collagen-induced.Other models include ovalbumin-induced,proteoglycan-induced,cartilage-oligomer-induced matrix proteins,and spontaneous genetically modified arthritis.There are many modeling methods for rheumatoid arthritis,each of which has advantages and disadvantages.It is necessary to choose the appropriate experimental animal model according to the actual situation of the experiment.
KEY WORDS:Rheumatoid arthritis;Experimental animal model;Review
0引言
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是自身免疫性疾病的一种，自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。RA在国内成人患病率为0.32%-0.36%，女性患者为男性患者数量的2-4倍。RA在临床上的病理特征主要表现为三个方面：①关节局部炎症细胞浸润引发慢性炎症。②关节滑膜增生导致关节破坏、关节畸形、障碍、使疾病进入不可逆阶段。③关节进行性破坏，主要表现为骨侵蚀和软骨组织损伤。目前，RA的发病机制尚未完全明确，推测其是一个受抗原驱动的“激发连锁反应。而动物模型的建立和应用是研究RA的有效方法，尤其是使用与人类相似的动物模型[1]。有效的动物模型有助于了解RA的发病机制，也能够筛选出有效的治疗药物。RA的动物模型有多种，本文将对几种关节炎模型的造模方法、模型特点、发病机制以及优缺点[2]等方面进行比较分析。
1胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型
胶原蛋白是一类具有活跃生物功能的细胞外间质成分。目前已经发现并报道的胶原类型有13种，其中研究较透彻并与医用生物材料关系密切的为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ型胶原。Ⅰ型和Ⅲ胶原在皮肤和一些器官的实质中发现，而Ⅱ型胶原大量存在于关节软骨中，机体在正常情况下，Ⅱ型胶原是一种与免疫系统隔绝的蛋白，但在某些病理条件下却可作为一种自身抗原呈现出来[3]。这些现象提示，Ⅱ型胶原可诱导体内产生关节炎性质的自身免疫反应。根据这些论述，分别用Ⅱ型胶原免疫大鼠和小鼠，从而相继成功地建立了胶原性关节炎的模型。
1.1小鼠和大鼠CIA模型制备方法
小鼠CIA模型的制备：在4℃下将II型胶原溶于0.1mol·L-1的乙酸中（质量浓度为2g·L-1），搅拌使之充分溶解后置4℃冰箱中过夜。再将灭活的卡介苗置于液体石蜡中，配成2g·L-1完全佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）；将二者等体积混合、乳化，制成CII乳剂，将该乳剂于每只小鼠的尾根部皮内注0.1m致炎，第20d，腹腔注射该乳剂0.1mL作为激发注射。
大鼠CIA模型的制备：将II型胶原用0.1mol·L-1的冰醋酸溶解，配成2g·L-1的溶液，加等体积不完全佐剂（incom plete Frennd's adjuvant，IFA），使终质量浓度为1g·L-1。大鼠用乙醚麻醉后，鼠背部剃毛，自鼠尾部开始，用1mL乳剂分4-6个部位注射大鼠背部皮内，1周后注射0.5mL加强免疫1次[4]。
1.2大鼠和小鼠CIA模型的特点
小鼠CIA模型特点[5]：CIA小鼠致炎后第24天出现关节肿胀，首先是两个后足，然后是前足和尾部，第36天达最高峰。另外，在发病过程中，动物的毛色失去光泽，轻微脱毛，体质量减轻，伴有耳及尾部的炎症病灶。CIA小鼠致炎后第24天小鼠出现关节肿胀，首先出现红肿的是两个后足，然后蔓延到前足和尾部并日趋严重，第36d达最高峰。另外，大鼠CIA模型特点[6]：在发病过程中，动物的毛色失去光泽，轻微脱毛，体质量减轻，伴有耳及尾部的炎症病灶大鼠CIA模型特点，动物致敏7天后，部分大鼠的踝关节皮肤发红，轻度肿胀，病理切片显示轻度炎症；14天后大部分大鼠踝关节出现肿胀，足踝部皮肤发亮、充血，关节活动受限，病理切片显示滑膜组织增生肥厚，有较多炎细胞浸润；21天后关节肿胀继续加重，部分大鼠出现皮肤溃疡，病理切片显示有丰富的血管翳形成，关节软骨受到侵蚀；5-6周后病理改变进一步加重，关节软骨及软骨下骨质均受血管翳的侵蚀和破坏[2]。
1.3发病机制
CIA的病理改变表现为关节滑膜的T细胞，B细胞的增生、浸润；CD4+细胞是CIA的主要调节因素，而抗CII自身抗体、炎性细胞因子等体液免疫因素也在其病理过程中起到重要作用[7]。
1.4CIA模型优缺点
该模型优点[6]以及与人类RA相似之处：（1）临床症状类似RA，对称关节受累，侵犯肢体远端关节。（2）病理学改变也是增生性滑膜炎，从滑膜炎渐进到血管翳的形成，开始都是边缘损坏，最终关节软骨破坏，直至骨的破坏；单核细胞浸入并持续存在于滑膜中。（3）有针对CⅡ的自身免疫，并受MHC及相关基因控制；细胞免疫和体液免疫变化明显。（4）都有热休克蛋白的变性。（5）有别于其他针对器官特异性抗原的实验性自身免疫模型，CIA由同类组织成分仅与不含细菌制剂的IFA或石蜡油就能产生自身免疫；评估药物对各项免疫指标影响时，不像AA受其细菌或其组分干扰。CIA模型不足[8]之处：（1）发病时间、临床表现不一：同种属同周龄相同诱发因素和生活环境下，发病时间也相差很大，临床表现轻重不一。（2）CIA是一种实验诱发的疾病，不出现复发情况，也没有RA的皮下结节、浆膜炎、血管炎等表现，不出现抗核抗体等，CIA只能反应人类RA的某一或某些特征。但是它已是目前公认的RA的最佳模型，特别是在与治疗机制及免疫反应有关的研究中，CIA模型的优点将为研究者提供极大帮助[9]。
2佐剂诱导的关节炎(Adjuvant arthritis，AA)模型
佐剂性关节炎模型由细菌学家Freund于20世纪50年代创立，故又称弗氏佐剂关节炎[1,3]，分为CFA和IFA。CFA是用液体石蜡与无水羊毛脂按2：1或6：4比例混合的混合液1mL，高压灭菌加入80℃灭活1h的减毒卡介苗或干燥结核死菌10mg制成。不加卡介苗的为IFA。
2.1AA模型制备方法
鼠出现一种与ＲA非常相似的侵袭性关节炎。有研究表明，此模型的发病机制可能是神经系统和免疫系统之间的双向调节，且有造模多采用大鼠，将充分乳化混匀的CFA(终质量浓度10g/L)用足跖部皮下注射法，一侧一次注入0.1mL。原发病变主要表现为致炎局部的炎性反应，续发病变一般于致炎后10-20天左右出现，20天左右达到高峰[10]。
2.2AA模型特点
炎症以踝关节为重，可侵及足垫、全足。病理改变为滑膜下组织炎症，滑膜增生，血管翳形成，软骨破坏；4周后关节红肿减退，骨质减少，新骨形成，关节间隙变窄，形成不可逆的关节改变[11]。
2.3AA模型的发病机制
AA的发病原理主要是分子模拟理论。结核杆菌的一个蛋白分子与关节滑膜上的一个糖蛋白分子结构相似，可以被同一株T细胞克隆所识别，从而诱发针对关节的免疫反应。此模型存在明显的细胞免疫异常，为一种典型的免疫性炎症模型[12,13]。
2.4AA模型优缺点
AA大鼠与RA患者在关节肿胀方面具有某些相似性，但AA大鼠存在明显的细胞免疫异常，表现出较为明显的免疫功能紊乱现象，如Th和Th2、Th和Ts之间的平衡异常等，而RA患者多同时表现出体液和细胞免疫功能的异常，这可能是AA大鼠免疫功能紊乱与RA患者的不同之处[9]。
AA大鼠模型的方法简单易行，其病理表现也类似于RA，在我国被广泛用于RA或防治RA药物的研究，但在病理生理学特点又有一定的差别。因此，单独使用AA大鼠作为研究RA的模型，还存在一些局限性。
3卵蛋白诱导的关节炎模型
3.1卵蛋白关节炎模型的制备
最早由Dumonde和Glynn于1962年创立，方法为用卵蛋白(Ovalbumin)溶解于生理盐水，配成20g/L的溶液，与等量弗氏佐剂混匀，注入动物背部皮下致敏，每次1mL，每周1次，连续3周致敏，末次注射后1周，于关节内注入5mg溶解的卵蛋白，24h内此关节直径和表面温度大幅度上升，以后缓慢下降，至14-21d达到平台期，发病率达100%[14]。
3.2卵蛋白关节炎模型的特点
第一阶段为关节内注入抗原后24h出现关节肿胀，关节直径可增加32%，病理表现为急性滑膜炎，大量渗出液。随后关节肿胀有所减轻，但仍比正常关节肿大。第二阶段为1-4周，关节滑膜明显增生，血管翳形成，滑膜细胞由1-3层增至5-10层，以单核细胞、巨噬细胞为主，其次为淋巴细胞，以CD+4T的淋巴细胞多见，这一阶段部分动物可出现早期软骨破坏。第三阶段在4周后，出现不可逆的关节软骨及骨破坏，有软骨细胞的坏死、软骨纤维化、软骨下新骨形成，最后可出现骨变形，最长的观察到6个月时慢性炎症仍存在[15]。
3.3卵蛋白关节炎模型的发病机制
卵蛋白诱导的关节炎模型的发病机制主要是由于关节内抗原的持续存在，刺激滑膜细胞分泌抗体，形成抗原-抗体复合物，使滑膜炎持续存在，滑膜增生，血管翳形成[5,16]。
4蛋白多糖诱导的关节炎
在IFA或CFA中的人胚软骨蛋白多糖分三次腹腔注射易感品系，4周以后可导致慢性多关节炎的发展，雌性小鼠较雄性易感，多关节炎的发展、类风湿因子的存在、免疫复合物的沉积，显示这种模型具有一些与RA相似的特征。然而，小鼠可发生特征性的脊柱炎，人的RA却不具有这种特征。在一些关节炎小鼠可观察到Ⅱ型胶原抗体存在，显示有对Ⅱ型胶原的继发反应而损害软骨，这一点与人的RA相似。同时可观察到免疫复合体的存在[17]。
5软骨低聚体基质蛋白（COMP）诱导的关节炎
这种模型的具体操是将COMP溶液与等体积的完全佐剂乳后，在大鼠尾巴根部皮内注射免疫。这种模型有这样的特点，COMP可诱导严重的关节炎，其外周关节症状在临床上与RA相类似，但并不产生持久的关节破坏，疾病的发展过程依赖于对COMP的免疫反应，并且与其他大鼠的胶原无交叉反应[6,18]。
6自发性基因修饰关节炎模型
转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物，用这种方法建立的转基因动物模型可用来研究外源基因在整体动物中的表达调控规律[19]。
6.1K/BxN小鼠模型
K/BxN小鼠来自于KRN-C57BL/6 T细胞受体转基因小鼠与NOD小鼠杂交后代，能自发产生关节炎。出生4-5周，K/BxN小研究进一步显示神经系统中垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)对此模型有调节作用[5,20]。
6.2人类TNF-α转基因小鼠模型
人TNF-α转基因(Tg197)小鼠高水平表达可溶性跨膜人TNF-α，导致关节炎。把从人TNF-α转基因小鼠滑膜细胞获得的成纤维样滑膜移植到正常小鼠身上可诱导滑膜炎、软骨损伤、骨损伤，进一步验证了参与该关节炎模型的免疫细胞相对缺乏。有研究显示Wnt信号通路在骨骼发育和关节软骨和骨转换中起着举足轻重的作用，而Wnt抑制因子-1(WIF-1)可能参与了微调软骨和骨转换，促进软骨与骨合成代谢的平衡。
6.3SKG模型
SKG小鼠是一种遗传背景为Balb/c，具有隐形突变基因的自发关节炎模型，能够依靠T细胞介导自身免疫，隐形突变的基因介导SH2区域的ZAP-70蛋白的表达，其机制主要是T细胞介导，这种模型高度依赖IL-17以及其它细胞因子的表达。当敲除TNF-α、IL-1或IL-6基因后，SKG模型的发病率和严重程度明显下降。有研究显示，此模型中Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞增加，且脾脏中ICOS+滤泡辅助性T、卵泡和成熟的B细胞有所增加，但Treg细胞减少。
7结语
目前应用于实验的RA动物模型有很多种，其中应用最广泛的是AA大鼠模型和CIA小鼠模型。这两种模型在临床表现、实验室指标和病理机制上，既有各自特点，又有许多相似之处，且与人RA在临床表现、病理、免疫有着相似或相近的特点。其中CIA小鼠模型主要应用于，治疗机制及免疫反应有关的研究中；AA大鼠模型广泛用于RA或防治RA药物的研究。然而，这些RA动物模型对人RA临床试验的指导作用仍存在一定差距。所以，探寻一种与人的种属较接近的、较容易建立的、比较经济的、能全面反映RA特点的动物模型是今后研究RA动物模型的重要研究内容之一。
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