EB病毒通过c-mpl基因影响儿童急性淋巴细胞白血病预后分析论文

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摘要：目的 探讨EB病毒(EBV)感染与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)病人预后的关系。方法 收集2001年-2010年重庆医科大学附属儿 童医院初诊儿童ALL病例资料，统计分析EBV感染与儿童ALL预后及临床特征间的关系、血小板数量对儿童ALL风险分层的作用。前瞻性 收集携带/不携带EBV感染的白血病病人及对照的骨髓样本，探讨EBV感染调控血小板水平的可能原因。结果 首先，通过回顾性分析发现 EBV IgG阳性预测较差的儿童ALL预后，且与温度(P＜0.001)、淋巴结肿大(户=0.049)及外周血小板计数相关(P＜0.001)。为验证EBV IgG阳性与外周血小板计数对儿童ALL预后作用的一致性，我们分析了外周血小板计数对危险分层的预测作用发现：高危组中外周血小板计 数最低，且ROC曲线下面积具有统计学意义(P＜0.005) O最后，RT-PCR检测EBV感染的病人骨髓样本，及B系急性淋巴细胞株Raji(EBV 阳性)、Reh(EBV阴性)发现，EBV下调c-mpl ＜达。结论EBV感染正相关于儿童ALL差预后，可能与血小板相关，为研究EBV感染在儿 童ALL中的作用提供理论依据。

关键词：儿童急性淋巴细胞白血病；EB病毒；预后；血小板数量；C-mpl

本文引用格式：刘姗，邹琳.EB病毒通过c-mpl基因影响儿童急性淋巴细胞白血病预后分析[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(30):1-3.        ABSTRACT: Objective To uncover the relationship of EB virus infection with the prognosis of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods Retrospective analysis to find the correlation of EBV infection with the prognosis and clinical characteristics of pediatric ALL, and the effect of platelet count on stratification. Bone marrow specimens were used to investigate the possible mechanism for EBV regulating the platelet count. Results Firstly, EBV IgG positive predicted the poor prognosis of pediatric ALL, and is related with temperature(尸＜0.001)、Lymphadenectomies(p=0.049) and platelet count(尸＜0.001). Then, to identify the consistent, we analysis the predictive ability of platelet count on stratification of pediatric ALL, and find that platelet count is lowest in high risk group, and ROC is significant (尸＜0.005). Finally, the c-mpl gene is lower in bone marrow cells with EBV positive derived from pediatric ALL and Raji, rather than bone marrow cells without EBV negative and Reh, respectively. Conclusion EBV infection is correlated with the poor prognosis of pediatric ALL positively, that may be related with platelet, which provide the data for explaining the role of EBV on pediatric ALL.
      KEY WORDS： Pediatric acute lymphoblastic leukemia; EBV; Prognosis; Platelet count; C-mpl

0引言

       EB病毒(EBV),是最常见的人类病原体之一,95%的成人 感染过EBV且多为无症感染。白血病病人因免疫抑制剂的使用 常合并感染EBV,故EBV是白血病病人用药后尤其移植后病人 的常规观测指标。但EBV感染对儿童急性淋巴细胞白血病预后 的作用尚无明确报道。本研究主要从大样本的病例回顾性分析 角度探讨EBV感染对儿童急性白血病(ALL)预后的影响，并通 过前瞻性分析探索可能的机制。

1材料及方法

1.1病例资料、样本收集

       回顾性收集2001年至2010年间在重庆医科大学附属儿童 医院初诊为儿童急性淋巴细胞白血病病人的病例资料，病例资料 不全者且不能随访者排除在外，共收集到219份完整的病例资料; 收集2018年初诊为儿童急性淋巴细胞白血病病人的病例资料及 骨髓细胞20例(其中10例EBV IgG(+),10例EBV IgG(-)),收集 同期入院非儿童急性淋巴细胞白血病病人的病例资料及骨髓细 胞 20 例(其中 10 例 EBV IgG(+), 10 例 EBV IgG(-))。

1.2试剂与仪器

       细胞株Raji、Reh ( B-ALL来源)均购自中国科学院细 胞库；培养细胞所用：澳洲胎牛血清购自中国上海依科赛生 物制品有限公司(500mL,llG313);RPMI1640培养基购自美 国 Gibco 公 司(500mL,8118117)；RT-PCR 所 用 试 剂：RNAiso Plus(200mL,AHF1816A)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(200,A4301-l)及 QuantiNova SYBR Green PCR Kit(500,160018009)购自中国大连TaKaRa公司；荧光PCR仪购

13方法

1.3.1细胞培养

      含10%胎牛血清的1640培养基重悬Raji、Reh细胞，并置 于5%如2,37丁孵箱孵育。

1.3.2 RT-PCR

      收集白血病细胞，提取总RNA,检测RNA浓度并按照逆转 录试剂盒说明书完成逆转录，以cDNA为模板进行RT-PCR。引 物如下：c-mpl 上游弓I物 5' - CCTACTGCTGCTAAAGTGGCAAT -3', 下 游 5' -CAATAGCTTAGTGGTAGGTAGGA-3'； TPO ± 游 弓丨物 5' - TCTGTCCAGCCCCGTAGGTC -3',下 游 5' - GTTCCATCCACAGGTCCGTG-3' ； GAPDH 上 游 弓丨 物 5' - CAGCGACACCCACTCCTCCACCTT-3', 下 游 5'- CATGAGGTCCACCACCCTGTTGCT-3'。扩增体系如下：2x QuantiNova SYBR Green RT-PCR Master Mix 10 卩 1,正向和反向 引物(10 Hmol/L )各0.5卩1,模板2卩1, ddH2O补齐至20卩1。扩 增程序：95 °C 5 min;95 °C 20 s,58T： 20 s,72 °C 30 s,40 个 循环；每个样本设置3个复孔，实验独立重复3次，以GAPDH作 为内参,2- △△ CT计算基因相对表达量。

1.4统计分析

       两组间的比较均采用卡方检验;Kaplan-Meier生存分析评 估EBV IgG对急性淋细胞白血病病人生存时间的影响,P值采 用Log-rank计算；所有统计采用SPSS 17.0中文版进行分析，P 值均采用双侧检验，置信区间V0.05。

2结果

2.1 EB感染预测儿童急性淋巴细胞白血病病人差的预后

         接着，我们分析了 EBV IgG与临床症状的相关性，EBV IgG 阳性组及阴性组间患儿性别、年龄、免疫表型、遗传表型等临床表型均无统计学差异，但患儿高体温(户＜0.001 )、高比例淋巴结 肿大(户=0.014 )、低外周血血小板计数(户＜0.001 )，在EBV IgG 阳性组中更常见(表1 )。

2.2血小板计数指示儿童急性淋巴细胞白血病病人危险分层

       尽管，文献报道诱导后低血小板计数与早期差的治疗反应 相关，且可预测预后⑴。但，EB IgG(+)与未用药时的血小板数 量相关不可知。因此，为了分析用药前血小板数量与预后的相 关性我们在临床评估的高危、中危、低危组中分析血小板计数 情况。发现，高危组中平均外周血血小板计数最低，低危组中平 均外周血血小板计数最高(图2A )，且具有预测危险分层的能力 (AUC,0.664；户＜0.005 )(图2B ),说明低外周血血小板计数预测 不良的预后与EBV IgG(+)表达预测差的预后一致。

2.3 EB感染与血小板计数的关系

        EBV感染及白血病伴随有高温、淋巴结肿大现象，故该研 究中对高温及淋巴结肿大不进行深入探讨导致原因。白血病病人中血小板表现多变，而EBV IgG （ + ）组中低血小板计数患儿 明显增多，考虑EBV感染会导致血小板数量的改变。因此，我 们收集20例病人骨髓样本及病例资料，其中白血病患儿及对照 患儿各10例，白血病患儿中EBV IgG（+）5例，对照患儿中EBV IgG（+）5例，发现白血病患儿及正常组中EBV IgG（+）者血小板计 数均相对较高。

        而后，骨髓样本提取DNA,分析促血小板生成的关键基因血 小板生成素（TPO ）及TPO受体（c-mpl）的表达，发现白血病患 儿及对照组中EBV IgG（+）者c-mpl表达均较低，TPO无统计学 差异（图3A ）。同时，在Raji （ EBV阳性B-ALL细胞株）、Reh（ EBV 阴性细胞株）也证实，相较于Reh而言，Raji细胞低表达c-mpl（图 3B）_O因此，初步得岀结论儿童ALL中EBV感染导致c-mpl表 达降低，TPO不能有效刺激巨核细胞产生血小板，导致不良反应 出现，白血病预后较差。

3讨论
        目前研究中，除人类T细胞白血病病毒（HTLV-1 ）^［2］外，其 它的病毒均没有确凿的证据证明其是人类白血病的直接病因。 相关报告有：巨细胞病毒（CMV ）感染影响T细胞的完整性及基 因异质性⑶;免疫缺陷病毒（HIV ）增加ID0表达，从而促进T细 胞增殖⑷;EBV超增强子与STAT5同源，可决定红系、巨单核细 胞的分化⑸等。因此，我们推测,EBV可能不是人类ALL直接病 因，但具有相关性，可通过其他途径影响人类ALL的发生、发展。

       外周血血小板计数曾被认为是白血病差的预后标志⑹刀。随 着分子生物学的进展，更多确切的基因表型被发现，且外周血血 细胞计数不单纯受疾病影响，故被排除在白血病危险因素之外。 但，在白血病发生、发展过程中血小板的作用不容忽视。血小板 过多导致血管内凝血；血小板过少预测差的预后^［8］o越来越多 的临床数据证明，白血病治疗过程中血小板修正治疗能影响白 血病病人的预后⑼。我们的研究结果显示，外周血血小板计数 <50 x 1C）9/L更多岀现在高危人群中，也证明血小板计数在白血 病发展过程中的作用。


        外周血血小板计数降低可能原因为：血小板消耗过多、血小 板生成减少。因白血病是一种造血系统紊乱性疾病，可累及其 它系统，故这里我们更多考虑外周血血小板减少反应了造血功 能失调。多种因素可调控CFU-GEMM产生血小板及血小板的 释放过程，包括:TPO、SCF、IL-3、IL-6、IL-11等，尤其TPO参 与了血小板产生、释放的全过程^［10］o文献报道，TPO通过其受体 c-mpl激活巨单核细胞产生血小板，肺囊吸虫导致的血小板减少与c_mpl基因突变相关⑴】；同时，病毒感染导致造血前体细胞低 表达c-mpl"'、c-mpl参与多信号通路维持正常造血^[13]_o因此， 我们推测EBV感染降低c-mpl表达，从而导致血小板生成及释 放障碍,外周血血小板计数降低。

        综上所述，EBV感染可能通过降低c-mpl表达、从而降低 外周血血小板含量，导致儿童ALL的不良结局。该结论不仅为 EBV感染可能为儿童ALL病因提供了理论支持，同时也为临床 血小板纠正治疗提供了依据。

参考文献

[1] Zeidler L, Zimmermann M, Mori eke A, et al. Low platelet counts after induction therapy for childhood acute lymphoblastic leukemia are strongly associated with poor response to treatment as measured by minima residual disease and are prognostic for treatment outcome^]. Haematologica, 2012,97(3): 402-9.
[2] James T, Fi ven son D, Cotton J. Human T-lymphotropic virus 1 associated with adult T-cell leukemia/lymphomaQ]. Cutis,2018,102(l):4-7.
[3] Suessmuth Y, Mukherjee R, Watkins B, et al. CMV reactivation drives posttransplant T-cell reconstitution and results in defects in the underlying TCR§ repertoireQ]. Blood,2015,125(25):3835-50.
[4] Planes R, Bahraoui E. HIV-1 Tat protein induces the production of IDO in human monocyte derived-dendritic cells through a direct mechanism: effect on T cells proliferation J]. PLoS One, 2013.
[5] Zhou H, Schmidt SC, Jiang S, et al. Epstein-Barr virus oncoprotein superenhancers control B cell growthQ]. Cell Host Microbe,2015,17(2):205-16.
[6] Hara T, Mizuno Y, Ikuno Y, et al. Acute leukemia with normal platelet count at diagnosis J]. Acta Paediatr Jpn, 1990,32(5):515-8.
[7] Armstrong J, Pomeroy M, Fennelly JJ, et al. Prognostic factors in childhood acute lymphoblastic leukaemiafj]. Ir J Med Sci, 1990,159(2): 40-3.
[8] 杜朝阳，杨如玉，李超，等. 96例急性淋巴细胞白血病患者的临床预后 因素分析[J].中国实验血液学杂志，2018,26(4):1005-1010.
[9] Wandt H, Schafer-Eckart K, Greinacher A. Platelet transfusion in hematology, oncology and surgeryfj]. Ar Dtsch ztebl Int, 2014,111(48): 809-15.
[10] Michelson AD. How platelets work: platelet function and dysfunctionQ]. J Thromb Thrombolysis, 2003,16(1-2): 7-12.
[11] Ok Bozkaya I, Yarali N, Isik P, et al. Severe clinical course in a patient with congenital amegakaryocytic thrombocytopenia due to a missense mutation of the c-mpl gene J]. Turk J Haematol, 2015,32(2): 172-4.
[12] Koka PS, Kitchen CM, Reddy ST. Targeting c-mpl for revival of human immunodeficiency^ virus typel -induced hematopoietic inhibit when CD34+ progenitor cells are re-engrafted into a fresh stromal microenvironment in vivo。]. J Virol, 2004, 78(20): 11385-92.
[13] Kaus han sky K. Thrombopoietin and its receptor in normal and neoplastic hematopoiesisQ]. Thromb J, 2016,14(Suppl): 40.

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