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摘要：目的通过对临床上符合马凡氏综合征（MFS）临床诊断的患者进行分析并提供客观实验室依据，并对MFS患者家系进行FBN1基因突变筛查，希望发现这个家族的致病基因突变和基因突变位点，并探寻该家系的分子发病机制。
方法收集MFS患者资料，绘制家系图谱，签署知情同意书后分别采取家系成员中与先证者有血缘关系的人群的外周静脉血血样，提取基因组DNA，进行全外显子测序，再采用Sanger测序法验证。
结果通过基因突变筛查，发现该家系中患者的FBN1基因第58个内含子（序列NM-00138.4）出现一个新的7204+1G>A的碱基杂合替换，该突变为剪接突变可能引起剪接位点改变。
结论发现的FBN1基因第58个内含子（序列NM-00138.4）的剪接突变是该马凡氏综合征家系成员的患病原因。
关键词：马凡综合征；FBN1基因；突变；系谱
本文引用格式：辛国祥，赵军，赵友财.一个马凡综合征家系FBN1基因突变筛查[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(27):28-31.
Screening for FBN1 Gene Mutations in a Family with Marfan SyndromeXIN Guo-xiang1,2,ZHAO Jun2△,ZHAO You-cai1(1Weifang Medical College,Weifang,Shandong;2Linyi People’s Hospital,Linyi,Shandong)
ABSTRACT:Objective Through the analysis of patients clinically conforming to the clinical diagnosis of marfan syndrome and providing the objective laboratory basis,and the screening of FBN1 gene mutation in the family of MFS patients,we hope to find the pathogenic gene mutation and gene mutation site of this family and explore the molecular pathogenesis of this family.
Methods After the informed consent was signed,peripheral venous blood samples were taken from the population of the family members who are relat-ed to the probands,genomic DNA was extracted and the whole exon sequencing was performed,then Sanger sequencing was used for verification.
Results Through gene mutation screening,it was found that the 58th intron of FBN1 gene(sequence nm-00138.4)of the patient in this family had a new base heterozygous replacement of 7204+1G>A,which was a splicing mutation that might cause splicing site changes.Conclusion Splicing mutation of the 58th intron of FBN1 gene(sequence nm-00138.4)was found to be the cause of this marfan syndrome family member.
KEY WORDS:Marfan syndrome;FBN1 genes;Mutation;Family tree
0引言
马凡综合征(marfan syndrome，MFS)是累及身体多系统的具有临床表型异质性的先天性遗传性疾病[1]。据统计，此病的发病率约为1／5000-1／10 000[2]。
典型的MFS常表现为晶状体异位、二尖瓣脱垂、主动脉扩张以及骨骼系统的先天发育异常。此外，皮肤、口腔、肺以及硬膜等其他组织系统也可受累及。根据国际上采用的Ghent诊断标准[3]，具备两个以上系统的体征才支持MFS的诊断，否则诊断为马凡相关病症。
晶状体脱位是MFS在眼部的特征性临床表现[4]，此外，屈光不正、近视以及青光眼也常见于MFS。目前已知编码原纤维蛋白-1的基因FBNl(Fibrillin.1)突变可导致MFS或马凡相关疾病[5]。
我们对一个中国MFS家系进行FBNI基因序列分析，发现该家系所有患者在第58号内含子（序列NM-00138.4）出现一个新的7204+1G>A的碱基杂合替换。
1对象与方法
1.1研究对象
研究对象为临沂市人民医院就诊的1个常染色体显性遗传MFS家系。通过对家系成员病史和家族史询问，眼科及其他相关科室会诊，并依据“Ghent诊断标准”确立MFS诊断。
眼科检查包括视力、裂隙灯显微镜检查眼前节并进行数码照相，玻璃体，视网膜和视神经检查。X射线检查患者脊柱及四肢骨骼。
本研究严格遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》，在得到患者及家属的知情同意后，采集4名患者与2名表型正常个体外周静脉血8ml，并按DNA组提取试剂盒(上海斯信生物科技有限公司代理)提供标准流程进行分步DNA提取，提取的DNA样品经紫外分光光度计和1.5％琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度后于-20℃保存备用。
1.2方法
1.2.1血样采集
用抗凝管抽取受试者外周静脉血8ml，标记，混合均匀后送研究所进行细胞血浆分离，然后冷存在-80℃冰箱备用。
1.2.2基因组DNA提取
使用基因组提取试剂盒提取人基因组DNA，具体方法如下：
①先将无水乙醇加到漂洗液和缓冲液GD中，并将血液标本置于室温下平衡至标本完全溶解。
②取经RNaseA酶处理过的离心管，按顺序编号后加入500μl混匀的标本，随后加入细胞裂解液CLlml，充分混匀后10000rpm离心1min。弃去上清，留下细胞核沉淀。
③解冻并加入200μl血样与20μl蛋白质K混合。
④添加缓冲液GB200μl，彻底翻转充分混合后，70℃下放10min，并短暂离心以从管盖内壁除去水分，至溶液变清亮。
⑤加入200μl无水酒精混合均匀并充分涡旋15s，短时间离心。
⑥将溶液全部液加入GenClean吸附柱CB3内并以12000转/分离心30s，去除废弃物，将GenClean吸附柱CB3返回到收集管。
⑦添加500μl缓冲液GB，彻底翻转充分混合后，12000rpm离心30s，弃去液体，将GenClean吸附柱CB3返回到收集管。
⑧将700μl冲洗液GD（无水乙醇已加）加入到GenClean柱CB3中，以12000rpm离心30s，去除废物，将GenClean吸附柱CB3返回到收集管。
⑨向GenClean柱CB3中缓慢注入漂洗水500μl高速离心30s，设定速度12000转/分离心，完成后丢弃废液。将GenClean吸附柱CB3返回到收集管。
⑩重复此步骤一次。以12000转/分离心2min后，弃取废物，并把吸附柱CB3置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中的漂洗液。将GenClean柱套上一个干净的离心管中。
向吸附膜中间位置悬空滴加80μl洗脱缓冲液TB，分两次操作可以提高提取率，使溶液在室温放置5min，12000rpm离心2min。将溶液收集到离心管中并标号，置于-20℃冰箱中冻存备用。
1.2.3DNA浓度的测定
利用紫外分光光度计测定DNA溶液OD值并初步计算所提取的DNA的纯度和浓度,DNA OD260/OD280比值均达到1.5-1.8可以进行下一步实验操作。
1.2.4提取候选基因
选FBN1基因突变为候选基因并设计引物，Primer premier6.24软件设计引物序列，由上海生工生物有限公司合成。
1.2.5目的基因片段扩增和电泳检测PCR产物聚合酶链反应PCR扩增：以家系成员基因组DNA为模板，对FNB1外显子进行PCR扩增。
用梯度PCR仪进行PCR反应。反应条件：96℃变性30s，57℃退火30s。72℃延伸2min，共35-37个循环；72℃最后延伸5min。置于4℃-15℃。
1.3测序分析
对所得PCR产物分别进行Sanger测序，测序结果与UCSC基因序列进行参照比对，检测突变位点。
2结果测序结果发现家系中患者15号染色体的FBN1基因具有一个相同的突变位点，第58号内含子（序列NM-00138.4）出现一个新的7204+1G>A的碱基杂合替换，产生剪切点突变。而家系中的正常人无该突变,证明该突变与该家系的先天性晶状体脱位发病有关[5，6],见图1、图2。
3讨论
在本研究中，我们先确定了一个MFS遗传家系。然后对该家系患者进行FBN-1基因突变筛查，发现所有患者均携带有c.7204+1G>A突变，将原来的碱基G改变成了A，产生剪切点突变[5]，引起蛋白结构和功能改变。在家系正常人群中未检测到该基因突变位点。
FBN1基因(MIM:134797)定位于15q21.1常原染色体，编码230kdo的原纤维蛋白-1，原纤维蛋白-1是微原纤维的最主要和分子质量最大的组分[7]，主要作为弹性纤维的组成部分，并参与弹性纤维的形成，其次是单独地分布于器官的细胞外基质中，提供一种柔韧性的连接方式。
FBN1突变对广泛存在于各个系统的微原纤维的结构与功能产生影响，使心血管系统、肌腱、软骨、角膜和晶状体悬韧带以及皮肤、肺、肾等组织中微原纤维减少，导致疾病发现[8，9]。
在结构上，FBN-1蛋白主要包括五个功能域[9，10]，其在维持原微纤维蛋白稳定性上有主要功能的是EGF,TGF样区域及杂合区域，大多数FBN-1突变发生在FGF结构域，阻断微纤维聚合、影响高级结构的形成,产生异常蛋白[11]。同时,异常蛋白对蛋白水解酶敏感性增加,细胞外基质微纤维结构
裂解,弹纤维的稳定性下降,结缔组织产生异常改变[12]。
我们在FBN1基因内含子58中发现的c.7204+1G>A剪接突变，突变产生的新的剪切点移去了基因编码区原本有效的一部分,导致中间部分功能域有缺失,异常原纤蛋白单体产物的产生，导致晶状体异位。
综上所述，我们的研究进一步支持在不同种族中发现的FBN1内含子58中发现的c.7204+1G>A剪接突变为致病性突变，此突变也是首次在国内MFS家系中发现。
参考文献
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