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摘 要： 随着口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）被陆续批准用于表皮生长因子受体（EGFR）突变，间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排，ROS1 重排非小细胞肺癌（NSCLC），新一代肿瘤靶向药物已经逐渐被市场认可。与此同时。另一种受体酪氨酸激酶（RTK），肝细胞生长因子（HGF）受体（MET）的变异（点突变，扩增，蛋白质过度表达和融合）已经在非小细胞肺癌（NSCLC）中被逐步发现。
关键词： 微滴式数字 PCR；基因；药物
本文引用格式：陈坚, 徐容, 黎飒. 微滴式数字PCR 在MET 基因 14 外显子迁越突变中的运用[J]. 世界最新医学信息文摘 ,2018,18(99):126-127.
0引言
2001 年，Peschard 和同事报道，在 E3 泛素 - 蛋白质连接酶 c-CBL 的结合位点上，酪氨酸残基 1003 的突变消除了 c-CBL 与 MET 的结合，从而导致受体泛素化降低，MET 蛋白质降解，使 MET 持续激活并存在 MET 致癌活性[1-2]。Y1003 位于 MET 的近膜区域，由外显子 14 编码 [3]。
2006 年 Kong-Beltran 及其同事发现在肺肿瘤样本中的MET 基因外显子 14 周围的 5' 和 3' 剪接位点鉴定出单核苷酸突变和小片段缺失，并证明这些突变导致 MET 基因外显子14 的迁越 [4]。
直到 2015 年，Frampton 及其同事对 38,028 个肿瘤样本中 MET 基因外显子 14 改变的大规模分子分析才重新关注肺癌中的 MET 基因外显子 14 改变 [5]。也在这一年， HEK293 细胞系中使用 CRISPR/Cas9 系统的体外模型证明MET 基因外显子 14 缺失导致更高的 MET 蛋白表达水平，增强的 MET 磷酸化，延长的 MET 激活，以及增强的细胞生长， 集落形成和 MET 抑制剂敏感性 [6]。同一时间，不同的病例报道 MET 基因外显子 14 突变的NSCLC（MET 基因外显子 14 突变 + NSCLC）患者对 MET TKIs 有反应 [7-9]。
在不断的研究过程中，针对于 MET 基因外显子 14 突变的靶向药物也已经在临床或开发阶段。正基于此，新兴的微滴式数字 PCR（ddPCR）技术检测 MET 基因外显子 14 突变NM_000245.2:c.3028+1 G>A、NM_000245.2:c.3028 G>A）成为了一个方向。
微滴式数字 PCR 全称为液滴数字聚合酶链反应，该方法通过将样品 DNA 随机分配到分离的液滴中来精确定量靶核酸序列（模板），使得大多数液滴包含至多一个模板。然后使用水解探针以序列特异性方式扩增和检测每个液滴内的模板。发射序列特异性荧光信号的液滴的计数允许以优异的灵敏度和精确度量化样品中存在的该序列的拷贝数。可以通过使用针对每种模板的独特标记的探针来量化不同的模板， 例如野生型和突变体等位基因。探针上最常用的报告染料是FAM（荧光素）和 HEX TM，通过用双通道荧光检测器 1 分析每个液滴来测量两种染料的终点荧光振幅。ddPCR 数据很容易将其结果构建为二维散点图，其中两个通道中的荧光振幅相对于每个液滴相互绘制。在设计用于定性化两种不同探针实验中，液滴理想地分离成独特的组，其可包括 VIC（HEX） 阳性，FAM 阳性，双阳性和双阴性。
1方法
1.1核酸提取及质检。先经 HE 常规染色病理判定组织样本肿瘤位置及面积大小，用切片刀刮取 FFPE 白片的肿瘤组织按照 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 试剂盒提取核酸，提取完成-20℃保存，使用紫外分光光度计测定 DNA 纯度和浓度。当浓度低于 5 ng/μL 或者 260:280 比值高于 2.5 建议重新进行提取。
1.2引物设计
1.2.1上游引物：
ATGGTTTCAAATGAATCTGTAGACTACC
1.2.2下 游 引 物 ： CCCACTGAGGTATATGTATAGGTATTTCTC
2888、2888+1 野生型荧光探针 G：
VIC-AGCTACTTTTCCAGAAGGTA-MGB
2888 突变荧光探针 A：
FAM-AGCTACTTTTCCAGAAAGTA-MGB
2888+1 突变荧光探针 A：
FAM-AGCTACTTTTCCAGAAGATA-MGB
1.3PCR。使用老鼠、牛血清提取核酸进行测试，排除引物和探针出现非特异扩增的可能。随后实验室选用 5 种稀释的不同浓度（20、15、10、7.5、5 ng/μL）的靶核酸；不同的退火温度（53˚C-60˚C）；不同浓度的引物（400-1000 nM） 和探针（200-500 nM）。
PCR 反应液混合后，取 20 µL 产物及 70 µL 微滴生成油加入 DG8 Cartridge 对应孔中，使用 QX200 生成微滴，取40 µL 转移至 96 孔 PCR 板并封板。PCR 程序如下：95℃ 10min；（94℃ 30 s、55℃ 1 mun）40 循环；95℃ 10min；降温至 4℃保存。最后使用 QX200 读取信号。方法学建立后， 从特异性，重复性，稳健性和 DNA 降解的影响几个方面对该方法学进行了评估。
2结果
最佳反应体系为反应体系在引物浓度 800 mm，探针浓度在 450 nm，退火温度在 55˚C 为最佳，体系中建议添加15-20 ng 的 DNA 模板。使用人组织相邻的突变样本进行测试，未发现相互干扰，老鼠及牛未扩增，提示特异性较好；5天内同一样本经过连续 5 次检测，突变频率及结果判断无显著差异，表示重复性及稳健性良好；在室温保存14 d 的条件下，发现使用 PBS、水、TAE 分别进行复溶洗脱的样本存在样本拷贝数差异，其中 TAE 样本拷贝数最为接近，水洗脱样本发现拷贝数存在一定的降解（降低 30%-45%），建议核酸洗脱及保存使用 TAE。
3讨论
近年来，随着一线治疗药物（如 EGFR U790M）的耐药性被逐渐发现 [10]， 使用其它靶向药物对抗肿瘤成为了一种新的迫切需求。而有趣的是，MET 外显子 14 突变与肺癌中其他常见的基因组突变存在一定的相互排斥（ 例如激活KRAS，EGFR，HER2，BRAF 中的突变以及 ALK，ROS1 和 RET 中的重排），表明该特定 Met14 外显子突变与致癌性相关。体外研究表明，携带 MET 外显子 14 改变的细胞对capmatinib（INC280）非常敏感，这是一种高选择性和有效的 Met 抑制剂 [11]，因此，MET14 外显子突变检测在现在及未来一段时间将会成为检测的新热点。微滴式数字 PCR 是一种相对较新的技术，不需要外部校准物来测量靶 DNA 的绝对和相对拷贝数。现有的结果表明，使用该方法对 MET 基因 14 外显子的突变检测具有了极佳的特异性、重复性和稳定性，在每个样品低至数千至拷贝的情况下仍然能够获得良好的结果，适用于临床常规开展。
参考文献：
[1]Jeffers M,Rong S,Vande Woude G F.Hepatocyte growth factor/scatter factor-Met signaling in tumorigenicity and invasion/metastasis[J].Journal of Molecular Medicine,1996,74(9):505-513.
[2]Feng Y,Thiagarajan P S,Ma P C.MET signaling:novel targeted inhibition and its clinical development in lung cancer[J]. Journal of Thoracic Oncology,2012,7(2):459-467.
[3] rgan S L,Tsao M S.An overview of the c- MET signaling pathway[J].Therapeutic Advances in Medical Oncology,2011,3(1 Suppl):S7.
[4]Kongbeltran M,Seshagiri S,Zha J,et al.Somatic Mutations Lead to an Oncogenic Deletion of Met in Lung Cancer[J]. Cancer Research,2006,66(1):283.
[5]Frampton G M,Ali S M,Rosenzweig M,et al.Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors[J]. Cancer Discovery,2015,5(8):850-859.
[6]Togashi Y,Mizuuchi H,Tomida S,et al.MET gene exon 14 deletion created using the CRISPR/Cas9 system enhances cellular growth and sensitivity to a MET inhibitor[J]. Lung Cancer,2015,90(3):590-597.
[7]Waqar S N,Morgensztern D,Sehn J.MET Mutation Associated with Responsiveness to Crizotinib[J].Journal of Thoracic Oncology,2015,10(5):e29-e31.
[8]Mendenhall M A,Goldman J W.MET-Mutated NSCLC with Major Response to Crizotinib[J].Journal of Thoracic Oncology,2015,10(5):e33-e34.
[9] Jenkins R W,Oxnard G R,Elkin S,et al.Response to Crizotinib in a Patient With Lung Adenocarcinoma Harboring a MET Splice Site Mutation[J].Clinical Lung Cancer,2015,16(5):e101-e104.
[10] Kobayashi S,M.D,Ph.D,et al.Mutation and Resistance of Non–Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib[J].N Engl J Med,2005,352(8):786-792.
[11] Frampton G M,Ali S M,Rosenzweig M,et al.Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors[J].Cancer Discovery,2015,5(8):850-859.
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