SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘要：目的 探索血清类风湿性关节炎相关瓜氨酸化蛋白( RACP )的水平在类风湿关节炎( RA )诊断中的应用价值。 方法 采用随 机数字表法， 纳入南昌大学第一附属医院自 2020 年 7 月至 11 月收治的 RA 患者 133 例(包括初诊患者 62 例、经治病例 71 例)，非 RA 患者 151 例(包括骨关节炎 95 例、未分化关节炎 16 例、系统性红斑狼疮患者 40 例)和健康体检者 40 例，记录各研究对象的临床资料 并检测外周血 RACP、抗环瓜氨酸肽抗体( Anti-CCP ) 、类风湿因子( RF )、 C 反应蛋白( CRP )、补体 3 ( C3 )、补体 4 ( C4 ) 和免疫 球蛋白 G(IgG) 的水平，分析各指标的检出率及相互间的关系，比较各指标对 RA 的检测效能。结果 RA 患者血清中 RACP 的阳性率显 著高于非 RA 患者( 88.0% vs 19.9%，P<0.01 )。在 Anti-CCP 或 RF 阳性的 RA 患者中， RACP 的阳性率分别为 96. 1% 和 94.7% ；在 Anti- CCP 或 RF 阴性的 RA 患者中 RACP 的阳性率分别达 61.3% 和 47.4% 。RA 患者血清 RACP 的水平与 28 个关节疾病活动指数中的 CRP 浓 度( DAS28CRP )或血沉计数( DAS28ESR )均无相关性，但初诊 RA 患者血清 RACP 水平与变形关节数呈正相关(r=0.65，P<0.05 )。 RACP 、Anti-CCP 和 RF 诊断 RA 的敏感度分别为 88.0% 、76.7% 和 85.7% ，特异度分别为 81.7% 、96.9% 和 80.6% 。RACP 、Anti-CCP 联 合诊断 RA 的敏感度和特异度分别为 91.0% 和 79.6% 。结论 RACP 可作为 RA 诊断的敏感指标，且与 Anti-CCP 和 RF 具有很好的互补 性， RACP 与 Anti-CCP 联合可提高 RA 诊断的准确性，值得临床应用。
关键词： 类风湿性关节炎; 抗环瓜氨酸蛋白抗体; 类风湿因子; 类风湿性关节炎相关瓜氨酸化蛋白
Study on the application value of serum rheumatoid arthritis related citrullinated protein detection in the diagnosis of rheumatoid arthritis
ZHAO Hongshuai1,2, LUO Qing1, FU Peng1,2, GAO Yujie1, YE Yutao1, RAO Jiayue1, LI Junming1*
(1. Department of Medical Laboratory, Affiliated Hospital Of Nanchang University; 2. School of Public Health, Nanchang University, Nanchang,Jiangxi 330006, China)
Abstract: Objective To explore the application value of serum level of the rheumatoid arthritis related citrullinated protein (RACP) in the diagnosis of rheumatoid arthritis (RA). Methods 133 RA patients (including 62 newly diagnosed patients and 71 treated patients), non- RA patients (including 95 osteoarthritis,16 undifferentiated arthritis and 40 systemic lupus erythematosus patients) and 40 healthy subjects were recruited randomly. Clinical data of all subjects were recorded and the levels of RACP, Anti-cyclic citrullinated protein antibodies (Anti-CCP), RF, CRP, C3, C4 and IgG in peripheral blood were detected. The detectable rate of each index and the relationship between them were analyzed, and the detection efficiency of each index for RA was compared. Results The positive rate of serum RACP in RA patients was significantly higher than that in non-RA patients (88.0% vs 19.9%, P<0.05).In Anti-CCP or RF positive RA patients, the positive rates of RACP were 96. 1% and 94.7%, whereas, in Anti-CCP or RF negative RA patients, the positive rates of RACP were 61.3% and 47.4% respectively. There was no correlation between RACP level and DAS28CRP and DAS28ESR in RA patients, but there was a positive correlation between RACP level and the number of deformed joints in RA patients (r=0.65, P<0.05). The sensitivities of RACP, Anti-CCP and RF in the diagnosis of RA were 88.0%, 76.7% and 85.7%, and the specificities were 81.7%, 96.9% and 80.6%, respectively. The sensitivity and specificity of RACP combined with Anti-CCP in RA were 91.0% and 80.5%. Conclusion As a sensitive index for RA diagnosis, RACP, has a good complementarity with Anti- CCP and RF. The combination of RACP and Anti-CCP can improve the accuracy of RA diagnosis, which is worthy of clinical application.
Keywords: Rheumatoid arthritis; Anti-cyclic citrullinated protein antibodies; Rheumatoid factor; Rheumatoid arthritis related citrullinated protein
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis， RA) 是以关节损 伤为主要临床表现的一种慢性自身免疫性疾病，其主要病 理特点为滑膜组织的炎症增生和骨侵蚀， RA 的发病机制 与多种细胞、蛋白质有关 [1] 。RA 早期可致关节肿胀、疼 痛，若未得到及时治疗可进一步导致关节畸形和功能的丧 失，最终导致患者残疾、丧失劳动力，因此 RA 的早期准 确诊断对提高患者的生活质量和生存率非常重要 [2]。
目前 RA 的诊断主要依据临床表现、影像学检查和实 验室指标的检测， RA 的临床个体差异大、轻重程度不一， 而在 RA 早期影像学改变不明显， 所以实验室指标对 RA 的 早期诊断尤为重要。根据 2010 年美国风湿病学院(ACR) 和欧洲风湿病联盟( EULAR)合作修订的 RA 的分类标 准 [3]， RA 诊断的实验室指标主要是类风湿因子(RF)和 抗循环瓜氨酸化蛋白抗体(Anti-CCP)。然而， RF 诊断 RA 的特异度并不是很理想，在其他的自身免疫性疾病和 部分感染性疾病中也可能增高。Anti-CCP 是目前诊断 RA 特异度最好的实验室指标，但敏感度并不理想。因此，寻 找新的 RA 诊断标志物对于进一步促进 RA 的诊断具有重 要价值。
蛋白质的瓜氨酸化是蛋白质肽链中的精氨酸残基转化 为瓜氨酸残基进而导致蛋白质三维结构发生变化的过程。 由于发生了肽链基团和蛋白质的结构改变，蛋白质的瓜氨 酸化可导致免疫细胞对蛋白质免疫识别和应答的紊乱，进 而导致疾病的发生。蛋白质的瓜氨酸化在介导 RA 患者的 免疫异常中发挥了重要作用，由此产生的瓜氨酸化蛋白也 被发现是多种自身抗体， 尤其是 Anti-CCP 产生的重要靶抗 原。 RACP 是一类与 RA 特异度相关的翻译后修饰蛋白， 较早前就有研究发现， 瓜氨酸化蛋白在 RA 患者疾病发生 早期的血清中就会出现， 但其在 RA 临床诊断中的研究却 鲜见报道。本研究采用商品化的试剂盒对 RA 患者其他疾 病患者和健康对照者外周血中类风湿性关节炎瓜氨酸化蛋 白(RACP)的水平进行了检测， 并系统分析了其在 RA 诊 断中的应用价值 [4]。
1 材料与方法
1.1 研究对象的选择 选取 2020 年 7 月至 11 月在南 昌大学第一附属医院风湿科就诊的 RA 患者作为 RA 组，其诊断符合 2010 年 ACR/EULAR 修订的 RA 分类标 准 [3] 。选取同期在南昌大学第一附属医院就诊的骨关节炎(osteoarthritis，OA)、未分化关节炎( undifferentiated arthritis，UA )和系统性红斑狼疮( systemic lupus erythematosus，SLE)患者作为疾病对照组。OA 的诊断符合 《骨关节炎诊断及治疗指南》中骨关节炎诊断标准 [5]；SLE 诊断符合 2019 年 EULAR/ACR SLE 分类标准 [6]；UA 患者 的纳入标准：①至少有一个关节表现为红肿症状，且不能 用其他疾病解释，②未出现骨侵袭表现 [7] 。健康对照组选自南昌大学第一附属医院体检中心无疾病记录的健康体 检者。
所有研究对象在纳入时均排除妊娠或哺乳期妇女，肿 瘤患者， 有活动性感染或近期有感染的患者， 患有严重心、 肺、肝、肾、血液系统疾病的患者，以及同时伴有其他自 身免疫性疾病的患者。本研究获得南昌大学第一附属医院 医学研究伦理委员会批准，入组研究对象及其家属知情同 意并签署知情同意书。
1.2 临床资料收集及指标检测
1.2.1 收集所有研究对象的临床资料及相关实验室检查数 据 计算 RA 患者 28 关节疾病活动指数( disease activity score 28，DAS28 ) [8] 。同时，采集研究对象的清晨空腹静 脉血 5 mL，低速水平离心机(德国 Eppendorf 公司)离心 ( 3 500 r/min，5 min)分离血清后置于 -80 ℃冰箱冻存备用。
1.2.2 RACP 的检测 RACP 的检测采用酶联免疫吸附 法，试剂盒由广州市雷德生物科技有限公司提供，严格 依据说明书进行检测。结果判断：以血清样品检测结果 的 OD 值与临界对照品 OD 值比值(S/CO)作为 RACP 的 半定量水平，以 S/CO=1 作为 RACP 定性判断的临界值， S/CO ≥ 1 判断为阳性。
1.3 统计学方法 用 SPSS 25.0 统计软件进行数据处理分 析，首先进行正态分布分析，正态分布定量资料以 (x ±s)表示，非正态分布资料用 M( P25~P75)表示，符合正态 分布者采用 t 检验或单因素方差分析，否则采用非参数 检验；定性资料以例数或百分率表示采用 χ2 检验。采用 Spearman 相关分析研究各指标之间的相关性。用 Medcale 软件绘制受试者操作特征(ROC)曲线评价各检测指标对 RA 的诊断价值，应用 Z 检验比较各指标间 ROC 曲线下 的 AUC 值，以 P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 研究对象的一般情况及临床资料 本研究共纳入 RA 患者 133 例，包括初诊患者 62 例、经治病例 71 例， 其中女性 108 例( 81 .2% )，年龄 15~81 岁 [ 平均年龄 ( 51.81±12.88)岁 ]。疾病对照组共纳入非 RA 患者 151 例， 包括 OA95 例，SLE40 例，UA16 例， 其中女性 128 例 ( 84.7%)，年龄 14~86 岁 [ 平均年龄(50.32±15.59)岁 ]。 健康对照组共纳入 40 例健康体检者，其中女 32 例 ( 80.0%)，年龄 29~71 岁 [ 平均年龄(48.28±10.74)岁 ]， 年龄、性别与 RA 组相匹配。研究对象的一般情况及临床 资料见表 1。
2.2 RACP 的阳性率分析 各组研究对象的 RA 相关血 清学标志物的阳性率见表 2。RACP 在 RA 患者中的阳性率 88 .0% 高于非 RA 的疾病对照组( 19 .9%)和健康对照组 ( 12.5%)。在 RA 患者中，初诊和经治患者 RACP 的阳性 率分别为 87. 1% 和 88.7%。
与经典的 RA 血清学标志物比较： RACP 在 RA 患者中的阳性率与 RF 比较差异无统计学意义( 88.0% vs 85.7%， χ2=0.06， P>0.05) ，但高于 Anti-CCP ( 88.0% vs 76.7%， χ2=7.04，P<0.05)。在疾病对照组中， RACP 的阳性率高于 Anti-CCP ( 19.9% vs 4.0%，χ2=18. 17，P<0.05)， 与 RF 比较 差异无统计学意义( 19.9% vs 21.2%，χ2=0.08，P>0.05 )。
在健康对照组中， RACP 的阳性率高于 Anti-CCP ( 12.5% vs 0.0%，χ2=3.20， P>0.05)，与 RF 一致。
在 Anti-CCP 阳性和 RF 阳性的 RA 患者中， RACP 的 检出率分别为 96. 1% 和 94.7%。在 Anti-CCP 阴性和 RF 阴 性的 RA 患者中， RACP 的检出率分别为 61.3% 和 47.4%。
在病程 <2 年的 RA 患者中， RACP 阳性率为 84.5%； 在病程 2~5 年 RA 患者中， RACP 阳性率为 84.8% ；在病 程≥5 年的 RA 患者中， RACP 阳性率为 95.2% 高于前两 组，差异无统计学意义(χ2=3.07， P>0.05 )。
2.3 RACP 水平与 RA 经典的血清学标志物及 RA 疾病 活动度的相关性分析 RA 组血清 RACP 的水平高于疾病 对照组和健康对照组(图 1A)。疾病对照组血清 RACP 的水平也高于健康对照组，其中 UA 组 RACP 水平高于 OA 组(图 1B )。
RACP 水平与 RA 其他血清学标志物的相关性分析： Spearman 相关性分析结果显示， RA 患者血清 RACP 的水 平与患者的年龄和性别无相关，与血清 RF 水平也无相关 (结果未显示) ， Anti-CCP 阳性患者 RACP 水平与 Anti- CCP 水平正相关(r=0.367， P<0.05 )。
RACP 与 RA 疾病进程和活动性的相关性分析：血清 RACP 的水平在初诊和经治 RA 患者中差异无统计学意义 (图 2A) ， 不同病程的 RA 患者间差异无统计学意义(图 2B )。 Spearman 相关性分析结果显示， RA 患者血清 RACP 的水平与 DAS28CRP 、DAS28ESR 均无相关性(结果未显 示) 。但初诊 RA 患者血清 RACP 水平与变形关节数呈正 相关( r=0.65， P<0.05 )。
2.4 ROC 分析 以所有非 RA 研究对象为对照组的 ROC 分析结果显示(图 3 )，RACP 诊断 RA 的最佳截断值为 S/ CO=3 .44， 敏感度和特异度分别为 79 .0% 和 92 . 1%， 其ROC 下面积(AUC)为 0.90 ( 95%CI： 0 .86~0 .93 )， 略高于 RF 的 0.89 ( 95%CI： 0 . 85~0 .92)，低于 Anti-CCP的 0.920 ( 95%CI： 0.89~0.95)，但三者比较差异无统计学意义(P>0 .05 )。RACP 分别与 Anti-CCP，RF 联合后AUC 分别为 0.94 ( 95%CI： 0.91~0.96)和 0.93 ( 95%CI：0.89~0.95)， 与 RACP、RF 单一指标比较差异均有统计学意义(P<0.05 )。RACP、Anti-CCP 和 RF 三者联合后 AUC可达 0.95 ( 95%CI： 0.92~0.97)， 高于 RACP 和 RF 两者联合的效果(Z=3.28，P<0.05 )。
2.5 RACP 在 RA 诊断中的性能分析 各 RA 血清学标志物诊断 RA 的性能参数见表 3。RACP 诊断 RA 的敏感度高于 Anti-CCP ( 88.0% vs 76.6%，χ2=7.04，P<0.05)，但特异度低于 Anti-CCP ( 81.7% vs 96.9%，χ2=21. 19，P<0.05 )。
RACP 的敏感度和特异度都略高于 RF，但差异均没有统计学意义。Anti-CCP 在 RA 的诊断方面具有最好的特异度和阳性预测值，RACP 诊断 RA 的敏感度和阴性预测值最佳。三个指标或两个指标联合后的结果表明，RACP 与Anti-CCP 联合后比较合适，敏感度提高到 91.0%，特异度为 79.6%。
3 讨论
RA 是一种以关节滑膜炎为特征，并以多发性关节炎为主要临床表现，进而导致关节畸形甚至致残的自身免疫性疾病 [9] 。研究证明 RA 患者对瓜氨酸化的蛋白质可产生较强的免疫应答， 提示瓜氨酸化蛋白可能是 RA 致病的重要自身反应性抗原 [10] 。RA 患者瓜氨酸代谢失调是驱动和维 持抗瓜氨酸蛋白抗体的关键因素 [11]。瓜氨酸化蛋白是类风 湿性关节炎特异度自身抗体识别的重要抗原，产生的抗瓜 氨酸化蛋白抗体能直接或间接介导软骨侵蚀、骨质破坏， 在 RA 发病过程中发挥关键作用 [10] 。目前发现的结合瓜 氨酸化蛋白的特异度抗体包括抗核周因子( antiperinuclear factor) 、抗角蛋白抗体(antikeratin antibodies) 、抗聚角 蛋白微丝蛋白抗体(antifilaggrin antibodies) 和抗环瓜氨酸抗体(Anti-CCP) ，且这几种抗体的出现对诊断 RA 具有 高度的特异度， 其中 Anti-CCP 已成为诊断 RA 的重要血清 学标志物 [12]。然而由于检测技术的限制， 目前对 RA 患者 RACP 应用价值的研究却很少有报道。最近，有学者利用 高效液相色谱质谱联用技术建立了瓜氨酸化蛋白的鉴定方 法， 并发现在血清 Anti-CCP 阴性的 RA 患者滑膜组织同样 有瓜氨酸化蛋白的高表达 [13]， 提示瓜氨酸化蛋白在 RA 患 者中的检出率可能高于 Anti-CCP。本次研究选取了与早期 RA 鉴别困难的关节炎患者作为对照组， 更符合临床要求， 而且对一些 RA 或者 Anti-CCP 阴性的患者进行检测， 与传 统的实验室检测方法有很好的互补性。
研究发现， RA 患者血清 RACP 的检测阳性率高于 Anti-CCP，该结果证实了管晓龙等 [13] 的推测。然而， 研究显 示 RACP 诊断 RA 的特异度不如 Anti-CCP， 提示在其他疾 病特别是未分化关节炎患者同样存在一定水平的瓜氨酸化 蛋白。本研究发现 RA 新发病例组瓜氨酸化蛋白的阳性率 与 RA 复发疾病组比较差异无统计学意义， 尽管随着病程 延长 RACP 的阳性率有上升趋势， 提示 RACP 可能主要在 RA 的发生过程中发挥作用。进一步的研究也发现， RACP 的水平与 RA 患者的疾病活动性没有相关性， 但 Anti-CCP 阳性患者 RACP 水平与 Anti-CCP 水平正相关(r=0.367， P<0.05) ，而且初诊 RA 患者血清 RACP 水平与变形关节 数呈正相关( r=0.65， P<0.05 )。
在 RA 的诊断效能方面， ROC 分析结果显示， RACP 诊断 RA 的 AUC 达到 0.90，提示 RACP 可作为 RA 的诊断标志物。进一步的研究显示， 在 Anti-CCP 阳性的 RA 患者 中， RACP 的阳性率可达 96. 1%，在 Anti-CCP 阴性的 RA 患者中 RACP 的阳性率也能达到和 61.3%，即有一半以上 的 Anti-CCP 阴性的 RA 患者血清中可检出 RACP， 提示在 RA 诊断方面两者具有较好的互补性，具有较好的联合诊 断价值。研究结果也显示， RACP 与 Anti-CCP 联合应用于 RA 的诊断时，虽然特异度有所降低，但是敏感度可显著 提高到 91.0%。
本次研究 RACP特异度略低于应用相同试剂盒陈建芸 等 [14] 的研究， 敏感度高于该研究， 可能是因为本次实验纳 入的样本多半是有关节痛等相关症状的患者，导致对照组 RACP 阳性率略高。在部分非 RA 的疾病对照组患者和部 分健康人血清中也检出了较高比例的 RACP，尤其是在未 分化关节炎患者中的检出率达到了 31.2%，提示 RACP 诊 断 RA 的特异度并不是很理想。然而，考虑到 RACP 主要 是作为启动 RA 自身免疫应答的靶抗原在 RA 的发生过程 中发挥作用，可能也存在部分已经发生较高水平的蛋白质 瓜氨酸化，但尚未发生 RA 或尚未满足 RA 诊断标准的个 体。此前的文献报道显示，有约 29.4% 的 UA 患者最终会 发展为 RA[15]， 这也从一个侧面为我们的推测提供了支撑。 后期计划对这部分 RACP 阳性的非 RA 组研究对象进行随 访，了解这部分人群未来疾病的进展和发生 RA 的可能， 以评估 RACP 在预测 RA 发生中的可能作用。
综上所述，RACP 可作为 RA 诊断的新型血清学标志物， 并与 Anti-CCP 和 RF 具有较好的互补性，尤其是 RACP 与 Anti-CCP 联合应用可提高 RA 诊断的敏感度， 但其诊断 RA 的特异度和预测 RA 发生的作用尚需进一步的深入研究。
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