HSVgD蛋白ELISA检测方法的建立及应用论文

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摘要：目的通过多种ELISA法对单纯疱疹病毒（HSV）gD1、gD2蛋白的检测实验，确立一种操作简便、特异性强、灵敏度高的ELISA检测方法。

方法利用辣根过氧化物酶标记的HSV多抗以及HSV gD1、gD2抗原和未标记的多抗，分别通过双夹心ELISA法及竞争ELISA法对gD抗原进行测定。结果酶标记多抗的效价在1:800处，包被抗原在2μg/mL较合适，抗原抗体孵育时间在0.5 h左右最合适，竞争ELISA法对gD蛋白在纳克范围内的检测具有一定的线性，且R2值在0.95左右。结论建立的竞争ELISA检测方法简便、灵敏，可以用于定量检测血清和组织中的HSV gD蛋白，为HSV的临床及实验室的快速检测提供了技术支持。

关键词：单纯疱疹病毒；gD蛋白；ELISA检测；应用

本文引用格式：窦荣荣.HSV gD蛋白ELISA检测方法的建立及应用[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(70):165-166.

0引言

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是最早发现的人类疱疹病毒，也是所有人类病毒性疾病中最常见的病毒[1]。目前认为HSV基因组有34个基因，编码70多种蛋白质，其中包膜糖蛋白正式命名的有11种，分别为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM。它们以独特或复合体的形式在HSV复制循环及病毒的感染致病中发挥不同的作用[2]。HSV包膜糖蛋白D(glycoprotein D，gD)是HSV的结构蛋白之一，具有重要抗原表位，是目前公认的最主要的保护性抗原,在体内可引起高滴度的中和抗原，是目前疫苗研究的热点[3,4]。

目前对gD蛋白的检测有以下几种方法：（1）免疫学检测：又分间接ELISA法、ABC-ELISA法[5]、捕获性ELISA法[6]、双抗原夹心法、免疫荧光法（indirect IF）、条带免疫印迹法、单步表面细胞质基因组共振法、乳胶凝集试验。（2）基因检测法，又分为DNA探针杂交法[7]、PCR法检测。

1材料与方法

主要试剂：羊抗HSV1+HSV2多抗为Abcam公司产品。HSV gD-1、HSV gD-2抗原由本实验室自行纯化获得。小牛血清为国产。

主要设备：酶联反应板为深圳产96孔板。ELISA显色液由北京生物技术公司提供。辣根过氧化物酶为美国公司产品。酶标仪为上海产，型号为芬兰雷勃MK3。纯水仪为MILLPORE公司产品。

2实验方法

2.1山羊抗gD2多抗的HRP(辣根过氧化物酶)标记

本实验主要采用过碘酸钠法：称取HRP1mg溶解于0.2 mL蒸馏水中。向溶液中加入0.04 mL新配的0.1 M NaIO4溶液（浓度0.016 M），混匀，4℃静置30 min。加入0.16 M乙二醇水溶液0.1 mL，混匀，静置30min。将上述溶液装入透析袋中，对1 mM pH4.4的醋酸钠缓冲液(pH5.6)透析，4℃过夜。将多抗装入透析袋中，用0.01 M pH9.5的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜。将透析过的多抗（88,000 1 mg/mL,取1 mL）与活化后的HRP(44,000取1 mg）按照质量比1:1混合，然后加入5l 0.2 M pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0-9.5。放置4℃反应过夜。加0.05 mL新配的4 mg/mL NaBH4溶液（0.2 mg/mg酶），混匀，再置4℃2 h。将上述液装入透析袋中，对0.02 M pH7.4 PBS透析，4℃过夜。加入等体积甘油，置-20℃保存备用。

2.2gD1、gD2交叉ELISA反应

本实验所采用的多抗是针对gD2抗原的，但是gD1、gD2的抗原相似度很高，本步骤主要通过做gD1、gD2交叉抗原反应，来测定gD2多抗表位特异性如何。主要步骤如下：先96孔板包被gD1、gD2抗原，浓度1g/mL、2g/mL、4g/mL各两列八排，每孔100l，（稀释抗原用PH9.4的CBS溶液）各四列八排，4°过夜。次日将96孔板取出先用1×PBST(1×PBS，1％吐温20)洗涤5次，排干，再用封闭液(1×PBS，5％小牛血清)封闭，每孔130l，室温封闭2 h。弃封闭液，用PBST洗5遍，拍干。将标记好的山羊抗HSV-1+HSV-2多抗，用样本稀释液(1×PBS，5％小牛血清)按梯度：1：200、1：400、1：800、1：1600稀释后，每列按次序加样，第一排为空白，每孔100l，0.5 h，37℃孵育，孵育完毕用PBST洗5遍后拍干，每孔加底物显色液及显色缓冲液各一滴，室温避光静置10 min，取出每孔加终止液各一滴。酶标仪读数。

2.3双夹心ELISA法检测抗原滴度

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

2.4竞争ELISA检测抗原滴度

本步骤主要是将样本和酶标抗体混合后与固相抗原竞争结合，样本中抗原含量越多，结合在固相抗原上的酶标多抗就越少。进一步来确定gD2抗原滴度。主要步骤如下：第1 d先将96孔板包被gD1、gD2抗原，各六列，每孔100 ul，浓度为2g/mL（稀释抗原用PH9.4的CBS溶液），4°过夜。次日将96孔板取出先用1×PBST(1×PBS，1％吐温20)洗涤5次，排干，再用封闭液（1×PBS，5％小牛血清）封闭，每孔130l，室温封闭2 h。弃封闭液，用PBST洗5遍，拍干。将抗原（gD1、gD2）分别用样本稀释液（1×PBS，5％小牛血清）按20,000 ng/mL、10,000 ng/mL、2,000 ng/mL、200 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL稀释，将酶标多抗按：1：200、1：400、1：800稀释，1：200、1：400分别与gD1稀释抗原混合，1：400、1：800分别与gD2稀释抗原对应混合，37°孵育0.5 h。每列按次序加样，第一排为空白，加样后37°孵育0.5 h。孵育完毕用PBST洗5遍拍干，每孔加底物显色液及显色缓冲液各一滴，室温避光静置10 min，取出每孔加终止液各一滴。酶标仪读数。

3结果

3.1gD1、gD2交叉ELISA反应

观察图1、图2、图3，可以看出在相同的包被浓度及酶标多抗浓度下，gD1的OD值明显低于gD2，且gD1的OD值均低于1.0，可见gD1对gD2多抗的抗原性很弱





3.2双夹心ELISA法检测抗原滴度

抗原gD1、gD2浓度在纳克级别时测定的OD值均很低，其抗原很难被检测出，说明低浓度下双夹心ELISA法不适宜做gD蛋白的测定。

3.3竞争ELISA检测抗原滴度

观察表1及图4、图5可以发现捕获ELISA法来测定gD蛋白在纳克水平具有一定的线性。



4讨论

通过多种ELISA法对gD1、gD2的检测实验，我们发现竞争ELISA法对gD蛋白在纳克范围内的检测具有一定的线性。并且该方法耗时短，操作简便，成本低廉。因此我们可以设想通过大量多次重复实验，对gD2蛋白的含量检测建立一个固有的标准曲线，通过这个标准曲线可以对HSV病人进行简单的临床鉴定[8]。但如何控制实验误差以及大规模生产相似效价的酶标多抗，仍需要进行大量的实验支撑。

参考文献：

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[5]金庆文,侯熙德.巢式PCR与ABC-ELISA检测单纯疱疹病毒的比较[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,1997(3):135-139.
[6]徐静.HSV-1重组蛋白GST-G1为抗原的IgM捕获法ELISA的研究[J].实用临床医药杂志,2011,15(7):55-58.
[7]杜丽芳,张晓焕,高华,等.检测Ⅱ型单纯疱疹病毒DNA拷贝的real-timeqPCR方法的建立及其应用[J].中国生物制品学杂志,2016,29(10):1082-1086.
[8]綦鲁博,张保平.2型单纯疱疹病毒研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(92):34-35,40.

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