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摘 要：目的 采用转录组测序筛选下咽鳞状细胞癌中的 miRNA 的及其相关 mRNA，分析明显上调和下调的miRNA，建立下咽癌的 miRNA 表达谱并分析其生物学功能。方法 选取 2014 年 1 月至 2015 年 12 月在大连大学附属中山医院确诊为下咽癌的 5 例患者的癌组织和癌旁正常组织。
提取总 RNA 并进行转录组测序。筛选在下咽癌中差异表达的 miRNA，并进行功能分析。结果 筛选出 20 个与正常组织相比在下咽癌组织中差异表达的miRNA，其中上调表达的有 9 个，下调表达的有 11 个。上调表达的 miRNA 的表达倍数均大于 4，而上调表达最明显的是MIR2117，为 7.5315 倍。
在下调表达的 miRNA 中，下调倍数大于 2.0 倍的有 MIR101-1，MIR3671，MIR3188，MIR331，MIR3685，MIR29B1，MIR4305，MIR4265 及 MIR3157。其中，MIR3157 下调最明显，为5.98601 倍。位于这些 miRNA 20 kb 以内的 mRNA 有 32 个。结论 筛选出在下咽癌中差异表达的 miRNA，并分析了其可能调控的靶基因，为继续研究这些 miRNA 在下咽癌中的作用机制打下基础。
关键词： 下咽癌；转录组测序；miRNA；差异表达
作者：秦宇蓝, 卫来 , 王立志, 等. 下咽癌中miRNA 的差异性表达 [J]. 世界最新医学信息文摘 ,2018,18(67):6-7+9.
Differential Expression of MiRNA in Hypopharyngeal Carcinoma
QIN Yu-lan, WEI Lai, WANG Li-zhi, WANG Zhi-qiang (Corresponding Author)
(Dalian University Affiliated Zhongshan Hospital, Dalian Liaoning 116601)
ABSTRACT： Objective to screen miRNA and its related mRNA in hypopharyngeal squamous cell carcinoma by transcriptional sequencing, and analyze obvious up and down regulated miRNA, establish miRNA expression profile of hypopharyngeal carcinoma and analyze its biological function. Materials and. Methods choose cancerous tissue and normal tissue adjacent to cancer of 5 cases hypopharyngeal carcinoma patients diagnosed at Dalian University Affiliated Zhongshan Hospital from January 2014 to December 2015. Extract total RNA and carry on sequencing of transcriptional group. Screen miRNA with differential expression in hypopharyngeal carcinoma and carry on functional analysis. Results 20 differentially expressed miRNA were found in hypopharyngeal carcinoma tissues compared with normal tissues, of which 9 were up-regulated and 11 were down-regulated. Expression times of up-regulated miRNA were more than 4, and MIR2117 up-regulated expression was the most obvious, reaching 7.5315 times. Among downregulated miRNA, downregulated times of MIR101-1, MIR3671, MIR3188, MIR331, MIR3685, MIR29B1, MIR4305, MIR4265 and MIR3157 were more than 2.0. Among them, downregulation of MIR3157 was the most obvious, which was 5.98601 times. There were 32 mRNA within miRNA 20 kb. Conclusion screening miRNA with differential expression in hypopharyngeal carcinoma and analyzing possiblely regulated target genes, lays foundation for continued study of miRNA mechanism in hypopharyngeal carcinoma.
KEY WORDS： Hypopharyngeal carcinoma; Transcriptome sequencing; MiRNA; Differential expression
0引言
下咽癌占全身肿瘤的大约 0.5% 及头颈部肿瘤的 5%[1]， 是头颈部肿瘤中恶性程度最高的肿瘤中之一。其病理呈现出易黏膜下浸润、易发生局部淋巴结转移的特点，且容易侵犯颈部其他重要结构，对基本生理功能（咀嚼、吞咽、呼吸等） 和言语功能产生较大破坏和影响。尽管目前下咽癌的治疗手段有手术、放疗、化疗及联合治疗方式，下咽癌的预后仍不理想，其平均 5 年生存率在 41.3% 左右 [2]。因此，研究下咽癌的发生发展机制，对今后制定下咽癌的个体化诊疗方案显得极其重要。
已有的研究表明，在肿瘤的发生发展中，除了蛋白质编码基因（mRNA），miRNA 也参与了调控肿瘤发生发展的重要生物学过程。它是一类长度约 21-25 个核苷酸的、短小的、不具备蛋白质编码功能的 RNA，它们可以通过降解其靶基因及抑制翻译过程等发挥生物学作用。其已被证明参与了细胞的发育、分化、增殖及凋亡等过程 [3]。在乳腺癌 [4]、肺癌 [5]、食管癌 [6] 等肿瘤中差异表达。目前与下咽癌相关的 miRNA 研究虽有报道 [7]，但以转录组为基础的表达谱筛选还是一个具有广阔前景的研究领域。
本文旨在通过转录组测序，筛选出在下咽癌中差异表达的 miRNA，并分析位于这些 miRNA 上下游 20kb 以内的蛋白质编码基因，进行生物信息学分析，筛选出这些相关基因参与的基因通路，为进一步研究这些 miRNA 在下咽癌中的生物学功能奠定基础。
1材料和方法
选取 5 例 2014 年 1 月至 2015 年 12 月在大连大学附属中山医院耳鼻咽喉二科确诊为下咽癌并接受手术治疗的患者。每例患者均取其下咽癌组织及癌旁正常组织，在离体 15 分钟内放入准备好的液氮罐中，然后在半小时内移至 -80℃ 冰箱中保存至核酸提取。直接采用 DNA&RNA 提取试剂盒 （AllPrep®DNA/RNA/miRNAUniversalKit（ 德 国QIAGEN 公司））提取总RNA，核酸分析仪检测总RNA 质量。采用 Illumina 公司的标准 RNA 建库及上机试剂盒进行测序（（NextSeqTM 500，美国 Illumina 公司））。
即从每个样本中取用 0.1 至 1 微克的总 RNA 进行文库构建，包括去除核糖体 RNA（rRNA）、合成 cDNA、富集 DNA 片段与文库测序。采用 OncoDecoderTM 系统（基恩生物科技有限公司） 分析软件进行数据处理。该软件可进行质量控制、排序、局部重排、突变调用、小插入和删除标识、拷贝数变异分析和覆盖计算。本研究以 P< 0.05 为标准，筛选 miRNA 及其 20kb 以内的上下游 mRNA。
2结果
2.1提取的总 RNA 的质量测定结果。RNA 的质量主要检测及浓度和纯度。A260/A280 比值是一种代表 RNA 纯度的检测方法，该比值应该在 1.8-2.0 之间，若纯度较低，样本可能被DNA 污染。总 RNA 浓度大于 300 ng/ul 为宜。通过表 1 可以看出，这 5 对样本的总 RNA 质量符合要求。
2.2转录组测序筛选的差异表达的 miRNA 及其 20 kb 以内的 mRNA。以 P< 0.05 为标准，筛选与正常组织相比在下咽癌组织中差异表达的 miRNA，如表 2 所示。
通过表 2 可以看出，上调表达最明显的是 MIR2117， 为 7.5315 倍。在下调表达的列表中，下调倍数大于 2.0 倍的有 MIR101-1，MIR3671，MIR3188，MIR331，MIR3685， MIR29B1，MIR4305，MIR4265 及 MIR3157 。 其 中 ，MIR3157 下调最明显，为 5.98601 倍。位于这些 miRNA 20kb 以内的 mRNA 有 32 个。有 6 个 miRNA 暂未发现其 20kb 以内存在相关 mRNA。
3讨论
miRNA 是上世纪 80 年代末首次在线虫中被发现，随后的研究表明，miRNA 是单链小 RNA，虽然不具备蛋白质编码功能，却能参与细胞的生长、发育等重要过程 [3]，尤其在肿瘤的发生、发展中起着重要的调控作用。它们可以参与转录后调控，影响 mRNA 的翻译及稳定性。研究显示，miRNA 多通过作用于其靶基因来控制肿瘤的发生与发展， 如 MicroRNA-34a 可以通过作用于靶基因 TGIF2 来抑制胃癌的侵袭与转移 [8]。
本研究通过分析转录组测序结果，发现了 20 个在下咽癌中差异表达的 miRNA，其中上调倍数最高的是 MIR2117， 下调倍数最高的是 MIR3157。MIR605 的 20 kb 以内的相关基因最多。MRI2117 与 MRI3157 在肿瘤中的研究比较少， 而 MIR605 在前列腺癌 [9] 中低表达时可通过使控制生长的基因 EN2 的高表达而促进肿瘤细胞的增殖与浸润。
我们以 20 kb 为标准，筛选出在转录组测序数据中存在差异表达的相关 mRNA。由于 miRNA 可以通过调控靶基因的表达来达到影响肿瘤发生发展的作用。而距离 miRNA 越近的 mRNA，它们之间存在相关性的可能性就越大。这些mRNA 可能是 miRNA 的靶基因。但是具体机制需进一步研究证实。我们的成果可以为今后的研究工作提供参考。
我们筛选出在下咽癌中差异表达的 miRNA，并分析了其可能调控的靶基因，为继续研究这些 miRNA 在下咽癌中的作用机制打下基础。
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