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摘要：目的研究真菌性角膜炎小鼠在不同光照条件下中性粒细胞的反应。方法取93只6-8周雄性SPF级C57BL/6小鼠，饲养在以下光照条件下，LD组小鼠从7：00-19：00接受光照（光强度110-210IW/cm2），LL组接受24h光照（光强度110-210IW/cm2），DD组24h黑暗，所有小鼠在LD环境下饲养7d，应用随机数字法，将小鼠平均分为三组，LD组、LL组、DD组，在相应光照条件下饲养12-15d。
制作真菌性角膜炎模型，其中12只小鼠只用于临床观察，分别于造模前0h，造模后12h、18h、24h、36h、48h、72h、120h、168h,使用裂隙灯显微镜进行眼前段照相及临床评分。
其余81只小鼠分别于以上时间点处死后进行取材，行免疫荧光染色角膜整铺片，使用单光子激光共聚焦显微镜，在40x油镜下对角膜整铺片进行扫描，使用图像处理软件，计算出不同时间点及不同实验条件处理下的小鼠角膜中中性粒细胞的浸润量。
结果LD组小鼠总体角膜炎症评分高于DD组，在造模后24h，LD组小鼠角膜炎症临床评分明显高于DD组，差异有统计学意义（P=0.008）。
LL组小鼠总体角膜炎症评分高于DD组，在造模后18h、24h、36h、168h，LL组小鼠角膜炎症临床评分均明显高于DD组，差异有统计学意义（P=0.013,0.004,0.008,0.022<0.05）。
LD组小鼠角膜中中性粒细胞浸润量总体高于DD组，在造模后12h、48h,LD组小鼠角膜中中性粒细胞的浸润量明显高于DD组，差异有统计学意义（P=0.033,0.009<0.05）。
LL组小鼠角膜中中性粒细胞浸润量总体高于DD组，在造模后12h、24h、48h,LL组小鼠角膜中中性粒细胞的浸润量明显高于DD组，差异有统计学意义（P=0.002,0.022，0.001<0.05）。造模后三个组中性粒细胞与临床评分呈明显正相关（r=0.192、0.454，P=0.019、0.000）。
结论在小鼠真菌感染阶段光有助于提高先天免疫细胞的招募,引起更多的中性粒细胞浸润，导致小鼠真菌性角膜炎更严重的炎症反应。
关键词：昼夜节律；真菌性角膜炎；中性粒细胞；小鼠
本文引用格式：王岁月,岳娟,刘素素,等.小鼠真菌性角膜炎中先天免疫细胞的反应是光调节的[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(27):1-3,10.The Response of Innate Immune Cells in Mice with Fungal Keratitis is Light-regulated
WANG Sui-yue1,YUE Juan2,3,4,LIU Su-su2,3,4,XIE Yan-ting2,3,4,SHI Ping-ling2,3,4,ZHANG Hongmin2,3,4,WANG Li-ya2,3,4△（1People’s Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou，Henan；2Henan Provincial People’s Hospital,Zhengzhou，Henan；3Henan Provincial Eye Hospital，Zhengzhou，Henan；4Henan Key Laboratory of Ophthalmology and Visual Science，Zhengzhou，Henan）
ABSTRACT:Objective To study the response of neutrophils of fungal keratitis in mice under different light conditions.
Methods 93 male SPF C57BL/6 mice aged 6-8w were selected and bred under the following light conditions，LD group mice received light from 7:00 to 19:00(light intensity 110-210IW/cm2),LL group received 24h light(light intensity 110-210IW/cm2),DD group received 24h dark，all mice were bred under LD environment for 7 days，the mice were divided into three groups,LD group,LL group and DD group，the mice were fed for 12-15 days under the corresponding light conditions.
To make fungal keratitis model,among which 12 mice were only used for clinical observation,respectively 0h before modeling,12h，18h，24h，36h，48h，72h，120h，168h after modeling,and slit lamp microscope was used for anterior segment photography and clinical scoring.
The rest of the 81 mice was performed after the above time point executed based respectively，immunofluorescence staining was performed on the whole cornea，using a single photon laser confocal microscope,the whole corneal film was scanned under 40x oil lens，the infiltration of neutrophils in cornea of mice treated at different time points and under different experimental conditions was calculated by using image processing software.
Results The total keratitis score of LD group was higher than that of DD group，at 24 h after modeling,the clinical score of corneal in-flammation of LD group was significantly higher than that of DD group(P=0.008).
The total keratitis score of LL group was higher than that of DD group，at 18h,24h,36h and 168h after modeling，the clinical scores of corneal inflammation of LL group were significant-ly higher than those of DD group(P=0.013,0.004,0.008,0.022<0.05)，at 12 h and 48 h after modeling,the infiltration of neutrophils in the cornea of LD group was significantly higher than that of DD group(P=0.033,0.009<0.05).
The infiltration of neutrophils in the cornea of LL group was higher than that of DD group，at 12h,24h and 48h after modeling,the infiltration of neutrophils in the cornea of LL group was significantly higher than that of DD group(P=0.002,0.022,0.001<0.05).The infiltration of neutrophils in the three groups was positively correlated with clinical scores(r=0.192,0.454,P=0.019,0.000).
Conclusion In the stage of fungal infection in mice,light helps to increase the recruitment of neutrophils，more neutrophils infiltrated,leading to more severe inflammation of fungal keratitis in mice.
KEY WORDS:Circadian rhythm;Fungal keratitis;Neutrophils;Mice
0引言
真菌性角膜炎（fungal keratitis,FK）是一种严重的致盲性眼病。真菌感染部位中性粒细胞的募集是抵抗真菌最重要的防线[1]。
中性粒细胞是真菌性角膜炎的关键免疫细胞。在感染早期大量中性粒细胞浸润角膜来杀灭真菌[2]。从蓝藻细菌到哺乳动物，在所有生物体中，昼夜节律是一种常见的由环境光驱动的生物现象。
在哺乳动物中，行为和生理的昼夜节律由下丘脑的主要昼夜节律控制:视交叉上核[3]。研究发现，持续光照明显延缓角膜上皮擦伤后的再上皮化过程，并引起更大的角膜炎症[4]。越来越多的证据表明光可以直接调节免疫系统。
一项研究表明，光在促进斑马鱼幼体对细菌感染的先天免疫应答中发挥重要作用，证实斑马鱼幼体对细菌感染的先天免疫细胞应答是受光调控的[5]。
真菌性角膜炎作为一种与免疫应答关系密切的疾病，在不同光照条件下中性粒细胞的反应尚未可知。在本研究中我们将会研究在不同光照条件下饲养的小鼠，角膜真菌感染后角膜中中性粒细胞的反应。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
93只6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量均在24-28g，均来自南京大学动物研究中心。均在(24±2)℃的SPF级动物房饲养，饲养期间可自由进食水。小鼠的使用和实验方案经河南省眼科研究所生命科学实验室管理和伦理审查委员会批准。
1.1.2实验用真菌菌株
腐皮镰刀菌(No.3.5840)来自中国通用微生物菌种保藏中心(CGMCC，北京，中国)。在2-3个亚种培养后，向含有生长良好的梭菌的倾斜培养基中加入2ml生理盐水。真菌菌丝用无菌玻璃棒研磨制成真菌悬浮液，用浊度计调节溶液得到0.5 Mx的真菌悬浮液。
1.1.3主要试剂及仪器
FITC Rat anti-mouseGr-1抗体(美国eBioscience公司)；PE anti-mouseF4/80抗体(美国eBioscience公司)；戊巴比妥钠（美国Sigma公司）；盐酸丁卡因滴眼液（日本参天制药有限公司）；封片胶（美国Sigma公司）。
单光子激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)；裂隙灯显微镜(重庆康华瑞明科技有限公司)；手术显微镜（苏州六六视觉科技股份有限公司）。
1.2方法
1.2.1真菌性角膜炎模型的建立
小鼠腹腔注射戊巴比妥钠80 mg/kg用于全身麻醉。采用质量分数为l%盐酸丁卡因滴眼液进行角膜表面麻醉。根据先前描述的方法[6]，建立真菌性角膜炎小鼠模型。具体方法如下:使用无菌碳钢手术刀片，在角膜中心2mm区域进行交叉划伤;然后用消毒过的竹棒将真菌接种到角膜上。
1.2.2实验动物的分组及处理
12只小鼠用于裂隙灯显微镜观察进行临床评分，81只小鼠用于角膜整铺片免疫荧光染色，应用随机数字表法将93只小鼠分为LD组、DD组、LL组，LD组老鼠收到光(光强度110-210 lW/cm2)从7点到晚7:00,LL组收到24h光(光强度110-210 lW/cm2),DD组24h黑暗,老鼠被安置在一个LD环境7d,然后转移到LD、LL或DD环境中12-15d[4,7,8]。小鼠经相应光照条件处理后建立双眼真菌性角膜炎模型。
1.2.3各组小鼠角膜病灶的裂隙灯显微镜观察及炎症反应评分各组小鼠于造模前0h、造模后12h、18h、24h、36h、48h、72h、120h、168h，进行裂隙灯显微镜下观察和眼前节照相，参照之前的评分系统[1]稍做修改后进行角膜病变临床评分，根据病变面积，角膜混浊和角膜新生血管形成记录临床评分。
病变面积A：1分（占角膜总面积的1-25％），2分（占角膜总面积的26％-50％），3分（占角膜总面积的51％-75％），4分（占角膜总面积的76％-100％）。角膜混浊度B：1分（角膜轻度雾状混浊，瞳孔虹膜清晰可见），2分（角膜浅层混浊，透过病灶可见瞳孔和虹膜），3分（角膜全层不均匀混浊），4分（均匀致密混浊）。角膜病灶表面粗糙，隆突C：2分。
前房积脓D：1分（少量积脓，未及旁中央）2分（大量积脓，达角膜旁中央）。角膜新生血管H：1分（新血管占角膜总面积的1-50％），2分（新血管占角膜总面积的50％-100％）。眼球肿胀，体积增大J：5分。角膜溶解，眼球萎缩K：6分。
1.2.4免疫荧光染色观察
LD组、LL组和DD组于相应时间时间点行裂隙灯观察后，以颈椎脱臼法处死小鼠，取角膜缘完整的角膜组织，2%甲醛固定60 min,2%BSA固定15 min,0.2%Triton X-100固定15 min,进行Gr-1-FITC和F4/80-PE双重染色，以1:50稀释，4℃孵育1夜，次日进行DAPI复染核，并进行角膜铺片及封片[1,9]。单光子激光共聚焦显微镜下行Z轴扫描，Z=6um。按参考文献[10]的方法，计数中性粒细胞的数量。
1.3统计学方法
采用SPSS 21.0软件对三组间的数据进行统计分析，实验数据表示为±s。三组角膜临床评分不符合正态分布，使用秩和检查。中性粒细胞浸润量通过W检验符合正态分布，使用单因素方差分析，方差齐采用LSD检验；方差不齐采用Tamhane´s检验。
对真菌性角膜炎角膜中中性粒细胞与临床评分进行Pearson相关分析检验，并对相关系数进行假设检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1三个组真菌性角膜炎模型不同时间点角膜病变严重程度变化在造模后12h，三组之间的临床表现没有差异，只有角膜中央的划痕和集落。
在18h三个组均出现前房积脓，角膜中央的灰白色浸润灶和旁中央角膜水肿，角膜不透明度增加，虹膜不可见，LD组和DD组临床评分无显著差异，LL组与DD组临床表现有明显差异（P=0.013）（图1，3）。
在24h LD组和LL组的角膜中央病灶面积和角膜混浊程度明显重于DD组，LD组和LL组的临床评分与DD组有统计学差异（P=0.008，P=0.004）（图1，2，3）。
36h时三组仍有前房积脓，差异存在于LL组和DD组（P=0.008）（图1，3）。
在48h时，尽管三组的角膜水肿减轻，但它们都有前弹力层膨出（图1）。三个组在72h时出现角膜穿孔和角膜缘新生血管（图1）。
在120h LD组角膜缘新生血管加重，LL组现眼球肿胀及角膜缘新生血管加重，三组临床表现无统计学差异（图3）。
在168h LL组出现眼球肿胀，临床表现明显重于DD组，差异有统计学意义（P=0.022）。三组的临床评分无显着差异（图1，3）。
2.2三个组真菌性角膜炎中中性粒细胞及巨噬细胞浸润情况同一时间点LD组与DD组中性粒细胞浸润量相比，12h和48h差异有统计学意义（P=0.033，0.009）（图4）。
同一时间点LL组与DD组中性粒细胞浸润量相比，12h、24h、48h差异有统计学意义（P=0.002，0.022，0.001）（图5）。三组的中性粒细胞的浸润量在真菌感染后12h开始升高，浸润量高峰出现在36h，随后逐渐下降（图4，5）。
2.3真菌性角膜炎角膜中中性粒细胞及巨噬细胞浸润量与炎症反应临床评分相关性分析对LD、LL和DD组真菌性角膜炎中中性粒细胞浸润量与角膜炎症反应程度进行Pearson相关分析，结果显示中性粒细胞与角膜病变炎症严重程度呈明显正相关（r=0.192，0.454，P=0.019，0.000）（图6）。
3讨论
越来越多的证据表明，光能直接调节免疫系统，尽管光在宿主和微生物相互作用中所起的具体作用还未可知[5]。也有研究表明慢性昼夜节律紊乱可导致炎症失调[9-11]，然而，对小鼠真菌性角膜炎昼夜节律扰乱后，不同的光照条件如何影响中性粒细胞免疫反应的研究还很少。
这项研究发现，小鼠真菌角膜炎中持续光照会导致过度兴奋的先天免疫反应，持续的黑暗显示较低水平的中性粒细胞的浸润。连续光照环境下的小鼠真菌性角膜炎中性粒细胞浸润更多，从而导致更严重的临床表现。此结果与Du,L.
Y.在斑马鱼细菌感染后光引起更多的先天免疫细胞的浸润结果一致[5]。
张红敏等[1]的研究表明小鼠真菌性角膜炎中性粒细胞的浸润量与炎症反应临床评分呈明显正相关，也支持此研究结果。
总之，此研究证明光能够积极调节小鼠角膜真菌感染后的先天免疫细胞的反应[12]，引起更多的中性粒细胞的浸润。这项研究为进一步理解在小鼠角膜真菌感染后光怎么调节先天免疫细胞的反应的分子机制提供了一个平台。
参考文献
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