SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘 要：目的 CtDNA 是来自于肿瘤细胞的血液游离 DNA，可以有效反映肿瘤的分子特征，这为我们研究晚期肺癌提供了重要的手段。方法 获得 36 例非小细胞肺癌外周血样本，腺癌 28 例，鳞癌 8 例，均为临床晚期患者。通过对患者外周血 ctDNA 二代测序获得 NSCLC 样本分子特征同时与临床预后进行分析。结果 36 例样本中， EGFR 突变 13 例（36.11%），PIK3CA，BRAF、KRAS、NRAS、MAP2K1 和 GNAQ 均有突变。11 例患者存在多驱动基因突变，包括 8 例患者存在双基因突变，2 例患者存在四基因突变，1 例患者存在三基因突变。36 例患者中有 27 例为治疗后进展患者，通过对 27 例治疗后进展患者的无进展生存时间进行分析，发现 EGFR 突变组显著优于 EGFR 阴性组（17.17±4.52）m VS （7.33±1.58）m，P =0.047。根据血液基因检测结果进行相应的临床用药，单基因突变或者基因突变阴性患者的6 个月生存率优于多基因突变患者。结论 晚期肺癌基因突变更为复杂， ctDNA 检测在晚期非小细胞肺癌治疗中具有重要的指导意义。
关键词： 肺癌；ctDNA；二代测序
Detection of ctDNA in Advanced Non-Small Cell Lung Cancer and Its Clinical Significance
LIN Xiao1, DONG Wen-tao2, LAI Xiao-jing1, FENG Wei1 XIAO Wen2, ZHENG Xiao1*
(1.Department of Thoracic Radiotherapy, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou, Zhejiang, 310000; 2. Hangzhou Heyi Gene Technology Co., Ltd., Hangzhou, Zhejiang, 310000)
ABSTRACT： Objective CtDNA is blood free DNA derived from tumor cells and can effectively reflect the molecular characteristics of tumors. This provides an important means for us to study advanced lung cancer. Methods 36 cases of non-small cell lung cancer peripheral blood samples, 28 cases of adenocarcinoma and 8 cases of squamous cell carcinoma were obtained. The molecular characteristics of NSCLC samples were obtained by sequencing the ctDNA of the peripheral blood of patients and the clinical prognosis was analyzed. Results In the 36 samples, 13 (36.11%) EGFR mutations, PIK3CA, BRAF, KRAS, NRAS, MAP2K1 and GNAQ were all mutations. There were multiple driver gene mutations in 11 patients, including 8 patients with double gene mutations, 2 patients with four gene mutations, and 1 patient with three gene mutations. Twenty-seven of the 36 patients were post-treatment patients. By analyzing the progression-free survival of 27 patients who progressed after treatment, it was found that the EGFR mutation group was significantly better than the EGFR-negative group (17.17±4.52 )m VS (7.33±1.58) m, P =0.047) According to the results of blood genetic testing, the 6-month survival rate of patients with single gene mutation or gene mutation negative is better than that of patients with multiple gene mutations. Conclusion The gene mutation of advanced lung cancer is more complicated, and ctDNA detection has important guiding significance in the treatment of advanced non-small cell lung cancer.
KEY WORDS： Lung cancer; CT DNA; Second generation sequencing
0引言
肺癌是一类严重威胁人类生命健康的恶性疾病，目前针对肺癌的治疗主要集中为手术、放化疗、靶向治疗等手段 [1]。有研究报道，利用 ctDNA 检测 EGFR-TKI 治疗肺癌患者， 发现 EGFR T790M 突变和 MET 扩增是导致晚期肺癌 EGFR- TKI 耐药的重要原因。本研究利用高通量测序技术，提取晚期肺癌患者血液 DNA，通过生物信息学方法分析 ctDNA 突变特征，了解晚期肺癌药物治疗后的分子特征，为后续治疗提供指导，同时探寻基因突变与疾病预后之间的关系。
1资料与方法
1.1一般资料。研究对象为 2017 年 1 月至 2017 年 10 月在浙江省肿瘤医院行血液 ctDNA 检测的 75 例恶性肿瘤患者。筛选出 36 例晚期肺癌患者，经组织病理学确认为 NSCLC， 临床分期为Ⅲ B-IVB 期（UICC 第 8 版 TNM 分期），治疗信息如附件。36 例患者均采集外周血行 ctDNA 检测。
1.2二代测序
1.2.1血液样本及 DNA 提取：使用 Streck 采血管采集 10 mL 外周血，轻柔颠倒 10 次，6℃ -35℃保存，备用。DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）用于血液 DNA 提取，提取的DNA（1）Nanodrop 检测DNA 的纯度（OD 260/280 比值）。琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 降解程度以及是否有 RNA、蛋白质污染。Qubit 对 DNA 浓度进行精确定量。其中 OD 值在1.8-2.0 之间，含量在 20 ng 以上的 DNA 样品被用来建库。
1.2.2文库构建及靶向捕获：将获得的 ctDNA 经末端修复和加 A 尾后在片段两端分别连接上接头制备 DNA 文库。采用自主研发的靶向捕获芯片，经过建库和文库捕获进行目标 DNA 的高效富集，然后在 Illumina NextSeq CN500 平台上进行高通量、高深度测序。建库使用的是 KAPA Hyper prep kit，测序使用的耗材为CN500 配套中通量芯片，备案号：浙杭械备 20150249，实验流程严格按照试剂盒和仪器说明书的最优化流程进行。
1.2.3测序及生信分析：根据库检合格文库的有效浓度及数据产出需求进行 Illumina CN500 平台 PE150 测序。测序结束获得原始测序序列（Raw Data）后，进行质控分析；变异信息通过 BWA 工具与人类基因组（hg19）进行比对，通过 GATK 对测序片段进行连接优化，SNP/Indel 通过VarScan2 获得，分析的结果通过千人基因组和 dbSNP 数据库进行过滤，以上分析均在杭州和壹基因科技有限公司完成。
1.3统计学处理。所有数据均使用 SPSS 22.0 统计软件进行统计分析，计量资料结果均以均数 ± 标准差（ ±s）表示， 两两比较采用 Fisher 精确检验，生存分析采用 Log Rank 检验，以P< 0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1患者信息。本研究回顾分析 36 例 NSCLC 患者，其中男 18 例，女 18 例；年龄 33-74 岁，平均 62 岁；病理分型按照世界卫生组织肺癌的组织学分类：腺癌 28 例，鳞癌 8 例； 吸烟患者 17 例，不吸烟患者 19 例；首次治疗患者 9 例，治疗后进展患者 27 例，临床分期以 IVB 期为主。
2.2测序结果。本研究分析 66 个常见靶向用药基因，36 例患者共获得 43 个用药位点突变，27 例（75%）患者至少携带一个靶向用药位点突变，其中腺癌 21 例，鳞癌 6 例。28 例腺癌患者中检测出突变率最高的基因为 EGFR，突变率为42.86%（12/28）、 其后依次为 KRAS 17.86%（5/28）、MAP2K1 10.71%（ 3/28 ）、PTEN 10.71%（ 3/28 ）、PIK3CA 7.14%（2/28）、BRAF 7.14%（2/28）、HRAS 3.57%（1/28）。8 例鳞癌患者中检测出 PTEN 和 GNAQ 的突变率为 25%（2/8），EGFR、PIK3CA、KIT 的突变率为12.5%（1/8）。详细结果如表 1 所示。
2.3多基因突变情况。共 11 例患者存在多驱动基因突变，包括 8 例患者存在双基因突变，2 例患者存在四基因突变，1 例患者存在三基因突变。多基因突变结果如表 3 所示。双基因突变中，与 EGFR p.T790M 共同突变的情况最多，占 50%（4/8）。
2.4EGFR 突变与病理分型的关系。肺腺癌患者中 EGFR 突变率最高，达到 42.86%，而在肺鳞癌患者中 EGFR 突变率为12.5%。通过对 EGFR 突变率与 NSCLC 病理分型进行分析， 发现肺腺癌 EGFR 突变率 , 高于肺鳞癌 [2]。
2.5血液 ctDNA 检测基因分析。对上述 21 例患者耐药进展后进行血液 ctDNA 检测，发现 9 例组织学检测 EGFR 突变阴性患者中有 8 例检测出基因突变（88.9%，8/9），其中 EGFR 突变 3 例（33.3%，3/9），KRAS、PIK3CA、MAP2K1 突变各 1 例（11.1%，1/9），BRAF、PTEN 双基因突变 1 例（11.1%， 1/9），KRAS、PTEN 双基因突变 1 例（11.1%，1/9）。12 例组织学检测 EGFR 突变患者中有 3 例在血液 ctDNA 检测中发现突变基因消失（25%，3/12），有4 例伴随有EGFR p.T790M突变（33.3%，4/12）， 有 3 例发生突变基因改变（25%，3/12），只有 2 例未发生改变（16.7%，2/12）。
对所有 27 例治疗后进展患者的血液 ctDNA 检测结果进行分析，有 8 例患者存在双基因突变（突变数 =2），19 例患者存在单基因突变或者突变阴性（突变数 <2）。根据血液ctDNA 检测的结果进行相应的临床用药，随访至 2018 年 4 月 30 日，共有 9 位患者死亡，突变数 =2 和突变数 <2 各有 5位和 4 位患者死亡。突变 =2 的患者 6 个月生存率为 50.00%（4/8），突变 <2 患者的 6 个月生存率为 84.21%（16/19）， 两者具有差异趋势，但不具有统计学意义（P =0.064）。
3讨论
NSCLC 是肺癌中最常见的类型，其病理分型主要为腺癌和鳞癌。目前认为组织活检是肺癌分子诊断的金标准。本研究通过对 36 例晚期 NSCLC 患者血液 ctDNA 靶向测序分析发现，27 例患者存在至少一个基因突变，EGFR 突变频率最高，达到 36.11%，其中腺癌为 42.86%，鳞癌为 12.5%。既往有文献报道 NSCLC 血液 ctDNA 检测 EGFR 突变率为20.4-43.0%，我们的结果与主流报道结果相一致。
EGFR 突变是肺癌中突变频率最高的用药基因，尤其在东方人群中。研究发现，在肺腺癌中 EGFR 突变高达 47.9%- 55.7%，而肺鳞癌突变频率要低的多。多基因突变在肺癌治疗中报道相对较少，过往研究报道多基因突变的频率为 3.13%-8.33%。我们的研究发现 36 例患者中有 11 例存在多基因或多位点突变，突变频率达到 30.56%，高于过往报道。我们推测可能有以下两个原因，首先，36 例患者均为晚期患者，且大部分为治疗后出现进展的患者，因此多基因突变情况存在升高的可能。其次，本研究的样本组成差异导致检测结果与过往报道存在一定差异 [3-4]。对 27 例治疗后进展患者的 ctDNA检测结果进行分析，有 8 例患者存在双基因突变，19 例患者存在单基因突变或突变阴性。根据血液 ctDNA 检测结果进行相应的临床用药，多基因突变患者的 6 个月生存率低于单基因突变和基因突变阴性患者，两者具有差异优势，但因局限于样本数量，差异不具有统计学意义。我们推测，多基因突变的患者，可能预示着更差的预后。
总之，本研究通过 ctDNA 二代测序揭示了一个真实世界晚期 NSCLC 患者治疗进展后的分子突变的特征，为液体活检用于肺癌晚期患者分子诊断提供了一个可能。同时我们发现对耐药进展后的患者行血液 ctDNA 检测，大部分患者发生了基因突变情况改变，因此对于耐药患者再次进行基因检测是非常必要以及重要的。研究中我们还发现，多基因突变患者的6 个月生存率低于单基因突变和基因突变阴性患者， 可能预示着更差的预后。综上，二次液体活检对后续 NSCLC 患者的治疗选择及预后提示具有重要意义。
参考文献
[1]Jemal,A.,et al.,Global cancer statistics,2012.Ca A Cancer Journal for Clinicians,2015,65(2):87.
[2]W,C.,et al.,Cancer statistics in China,2015.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115.
[3]Preusser,M.,et al.,Brain metastases:pathobiology and emerging targeted therapies.Acta Neuropathologi ca,2012,123(2):205-222.
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