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摘要：目的探讨芹菜素对肺癌A549细胞诱导凋亡作用。方法采用不同浓度的芹菜素作用于常规培养的肺癌A549细胞株，根据给药的不同分为空白对照组、药物对照组和芹菜素高、中、低浓度组。采用MTT法对A549细胞的增值能力进行测，Western blotting检测凋亡相关蛋白Akt的相对表达量，流式细胞术检测A549细胞凋亡水平。结果随着芹菜素浓度的增高，A549细胞的增殖抑制率明显增高，差异具有统计学意义（P<0.05）；芹菜素可调控肺癌A549细胞凋亡相关蛋白Akt的表达，随着芹菜素浓度的升高，Akt的相对表达量逐渐降低；芹菜素可促进肺癌A549细胞凋亡，凋亡率随其浓度升高和时间延长而增加。结论芹菜素能够有效抑制肺癌A549细胞增值，并诱导其凋亡，可为肺癌的临床治疗提供一定的参考。
关键词：芹菜素；A549细胞；细胞凋亡；诱导
本文引用格式：王娜.芹菜素促肺癌A549细胞的凋亡作用研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(100):22-23+26.
Apoptosis of Lung Cancer A549 Cells Induced by Apigenin
WANG Na
(Department of Biochemistry and molecular biology,Binzhou Medical University,Yantai Shandong/Department of infectious diseases,Penglai people’s Hospital,Yantai Shandong)
ABSTRACT：Objective To investigate the effect of apigenin on apoptosis of lung cancer A549 cells.Methods Different concentrations of apigenin were applied to A549 cell line.According to the different administration,it was divided into blank control group,drug control group and apigenin high,medium and low concentration group.MTT method was used to measure the value-added ability of A549 cells.Western blotting was used to detect the relative expression of apoptosis related protein Akt.Flow cytometry was used to detect the apoptosis level of A549 cells.Results With the increase of apigenin concentration,the proliferation inhibition rate of A549 cells increased significantly(P<0.05);Apigenin can regulate the expression of apoptosis related protein Akt in lung cancer A549 cells;Apigenin can promote the apoptosis of A549 cells,and the apoptosis rate increases with the increase of apigenin concentration and time.Conclusion Apigenin can effectively inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells and induce its apoptosis,which can provide some reference for the clinical treatment of lung cancer.
KEY WORDS：Apigenin;A549 cell;Apoptosis;Induction
0引言
肺癌是一种发病率较高的疾病，又称原发性支气管肺炎，其发病位置位于支气管粘膜和肺泡，约为肺部肿瘤的90%，是目前世界上发病率最高的癌症之一[1]。化疗是临床上常用于治疗癌症的手段，尤其是已经错过了最佳手术时期的患者，化疗的优势非常明显，但化疗往往具有诸多的不良反应，如骨髓抑制、胃肠道反应、脱发、口腔粘膜炎症等[2]，因此，能否找到一种效果显著且安全性高的的治疗方法，无疑是当代医学工作者亟待解决的问题。芹菜素是一中黄酮类化合物，化学结构为4’，5，7-三羟基黄酮，其结构中固有的3个羟基和双键结构决定了其特有的药理活性[3]。近年来，随着相关研究的增多，芹菜素的抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗突变作用越来越受到各方关注[4]。对于其抗肿瘤作用，有研究表明，芹菜素可诱导胃癌、膀胱癌细胞的自噬和凋亡，因此，本研究通过观察和研究芹菜素对肺癌A549细胞的诱导凋亡作用，以期为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料。人肺癌A549细胞株（中科院上海细胞所），芹菜素（含量98.1%，Sigma公司），兔抗人Akt抗体（Sigma公司），MTT试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司），RPMI-1640培养液[10%胎牛血清，1%双抗（链霉素100μg/mL，青霉素100 U/mL）]（天根生化科技有限公司）。
1.2试验方法。①细胞培养：将冻存的肺癌A549细胞株置于40℃恒温水浴锅中轻微震荡，融化后置入2 mL RPMI-1640培养液中，1000 r/min离心5 min，分离上清液，再次用完全培养液重悬后传代置培养瓶，加入培养液至5 mL，于5%CO2恒温培养箱中37℃培养24 h，换液，直至细胞融合率达到80%-90%，进行传代。②芹菜素溶液配制：取芹菜素用DMSO配制成浓度约为10 mmol/L的储备溶液，使用时稀释至相应的浓度。③试验分组及加药方法：种板24 h后换为无血清培养液，同时加入1μL PBS缓冲液和无菌生理盐水（空白对照组）、2 mg/L顺铂溶液（药物对照组）、20μmol/L芹菜素溶液（低浓度组）、40μmol/L芹菜素溶液（中浓度组）、80μmol/L芹菜素溶液（高浓度组）。
1.3MTT检测细胞增殖能力。将肺癌A549进行常规培养，取处于对数生长期的细胞接种于96孔板。待细胞贴壁后按照上述1.2项下加药方法进行加药，每组细胞分别培养和观察24 h、48 h。每组均设置4个复孔。向每孔中加入20μL的MTT溶液（5 g/L），并继续培养4小时，1000 r/min离心5 min，将上清液分离出去，加入DMSO 0.1 mL，于37℃震荡15 min，使其中褐色沉淀完全溶解，测定其在570 nm的吸光度，并计算芹菜素对肺癌A549细胞抑制率。抑制率=（对照孔吸光度-加药孔吸光度）/对照孔吸光度。
1.4Western blot法检测Akt相对表达量。取处于对数生长期A549细胞，以2×105的浓度接种于6孔板上，并按照上述1.2项下加药方法进行加药，药物持续作用24 h，使用裂解液使其完全裂解，并提取其总蛋白质，用BSA法测定蛋白质浓度试剂盒测定总蛋白含量。将含有蛋白裂解液的溶液用缓冲液溶解，将细胞裂解液用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，于5%的牛奶中封闭培养30 min，向其中加入聚二磷酸腺苷核糖聚合酶和Akt的一抗，于4℃中进行孵化过夜，次日用TBST洗涤后，加入经标记的二抗于室温进行孵化，后再显色。
1.5流式细胞术检测细胞凋亡。按1.4项下的方法处理细胞，并收集处理2小时的细胞，调整其浓度约为1×106个每毫升，用预冷的PBS洗涤细胞2次，弃去上清液。加入100μl的染料缓冲溶液使细胞重悬，加入染色剂染色，混匀后室温静置15 min，并避光，加入200μl染料缓冲溶液和5μL PI染液，室温静置5 min，立即使用流式细胞仪进行分析，并平行检测3次。
2统计学分析
所得数据均采用SPSS 19.0进行统计学分析，以P<0.05表示彼此之间存在统计学意义。
3实验结果
3.1不同浓度芹菜素对肺癌A549细胞增殖的影响。MTT法检测细胞增殖抑制率结果详见表1，由表中结果可发现，经过24 h和48 h的培养，随着芹菜素浓度的增大，吸光度值逐渐降低，均明显低于空白对照组（P<0.05），说明芹菜素对肺癌A549细胞的增殖抑制作用随浓度的升高而增加。药物对照组和3个不同浓度组培养24 h检测的吸光度值均明显高于培养48 h的吸光度值（P<0.05），对细胞增殖的抑制率也是培养48 h的明显高于培养24 h的（P<0.05），说明随着作用时间的延长，芹菜素对肺癌A549细胞的增殖抑制作用增加。
3.2不同浓度芹菜素对Akt相对表达量的影响。Western blot法检测芹菜素对肺癌A549细胞凋亡相关蛋白Akt的表达量详见表2，由表中数据可发现随着芹菜素浓度的升高，Akt的相对表达量逐渐降低，中浓度组高于低浓度组
（P>0.05），高浓度组显著高于中浓度组和低浓度组（P<0.05）。说明芹菜素对肺癌A549细胞可通过对Akt的调控促进肺癌细胞凋亡作用。
3.3不同浓度芹菜素对肺癌A549细胞凋亡的影响。流式细胞法检测芹菜素对肺癌A549细胞的凋亡率详见表3，由表中数据可发现，经过24 h和48 h的培养，药物对照组、高、中、低浓度组肺癌细胞凋亡率均显著高于空白对照组（P<0.05）；随着芹菜素浓度的增大，肺癌A549细胞凋亡率逐渐增大；药物对照组和3个不同浓度组培养24 h的肺癌A549细胞凋亡率均显著低于培养48 h的凋亡率（P<0.05）。说明芹菜素对肺癌A549细胞的凋亡有促进作用，且随浓度增加和时间延长，促进凋亡作用增强。
4讨论
肺癌的发生率和死亡率均居癌症发生率和死亡率的前列，特别是癌症的死亡率，是所有癌症患者中死因的第一位，对于肺癌的治疗目前所能采取和主要的治疗手段仍为化疗，但化疗会带来诸多的副作用，如疼痛，骨髓抑制，白细胞及血小板下降等。近年来随着科技的进步，对中医药的认识逐渐更加深入，特别是利用现代物理和化学的手段对中药进行更加科学的研究。芹菜素是一种广泛分布于伞形科、瑞香科、马鞭草科、卷柏科等植物中的化合物，特别是在伞形科植物芹菜中含量为高[5]。其本质为一种天然黄酮类化合物，国内外研究表明，其具多种生物活性：如抗肿瘤、抗病毒、心脑血管保护、抗菌等，且其据有不良反应少的优点。经过研究发现，芹菜素能够诱导A549细胞的凋亡，其原理主要为抑制Bcl-2基因和相关蛋白质的表达[6]。
Akt是一种靶蛋白处于PI3K下游的靶蛋白，当其被激活后，能够促进其他细胞的生长，从而使其具有一定的抗凋亡能力[7]。本研究对不同浓度的芹菜素对A549细胞的增殖情况和Akt蛋白的表达情况进行研究，结果显示不同浓度的芹菜素组，其A549细胞的增值情况存在一定的差异，但其增殖量均低于空白对照组，且具有统计学差异。Akt蛋白的表达亦呈现同样的表过，芹菜素浓度越高，其Akt蛋白的表达越低，均显著低于对照组。从而表明，芹菜素对A549细胞的增殖、Akt蛋白的表达均具有一定的抑制作用，且与浓度呈现正相关的关系。
由于芹菜素的来源为植物活性成分，能够抑制肺癌A549细胞的增殖和Akt蛋白的表达，具有一定的抗肿瘤活性，同时又具有副作用小的特点。因此，其具有良好的开发价值，用于辅助治理癌症。
参考文献
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[4]陈亭亭,杨培伟,张树辉.芹菜素抗肿瘤机制的研究进展[J].中国现代应用药学,2019,36(4):507-510.
[5]黎鹏,屠洁,张凡,等.芹菜素脂质体的制备工艺研究[J].江苏科技大学学报(自然科学版),2019,33(2):96-102.
[6]赵亚新,刘洁凡,钱海鑫.芹菜素逆转肺癌A549/DDP细胞耐药及机制[J].南京医科大学学报(自然科学版),2017,37(11):1385-1388,1394.
[7]于丹,王莹,高原,等.Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用[J].中国病理生理杂志,2018,34(6):1124-1128.
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