SCI论文（www.lunwensci.com）:
摘要：目的研究恩替卡韦对乙肝的治疗效果及免疫细胞功能的影响。方法选择2016年12月至2017年12月到医院就诊的74例乙肝患者作为观察组，选取同时期24例健康体检人员设置为对照组，所有观察组成员给予口服恩替卡韦治疗48周；在治疗前和治疗48周后两次采取其外周血，全自动生化分析仪测、化学发光分析仪检测、RT-PCR法检、流式细胞术检测、ELISA法检测所有患者的免疫功能生化指标；采取对照组等量外周血用于检测CD4+CD25+Treg、Treg及细胞因子水平，数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析。结果观察组恩替卡韦治疗后指标ALT、AST、HBeAg、HBVDNA等较治疗前显著降低（P<0.01），HBsAg治疗后与治疗前比较未见显著性差异（P<0.05）；给予治疗前，观察组外周血CD4+CD25+Treg和Treg显著高于对照组（P<0.05）。观察组在治疗后，外周血CD4+CD25+Treg和Treg均较治疗前显著下降（P<0.05）；其细胞因子水平与治疗前相比，IFN-γ水平显著升高，IL-10水平降低，但两者水平都高于对照组。结论乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg、Treg水平显著升高，血清IFN-γ和IL-10水平增加，恩替卡韦治疗降低ALT、AST水平，改善肝功能，降低HBeAg、HBVDNA含量，显著降低乙肝患者外周血CD4+CD25+Treg、Treg水平和血清IL-10水平，提高机体细胞免疫功能。
关键词：恩替卡韦；乙肝；免疫细胞；肝功能
本文引用格式：司进枚,王茜,陈民,等.恩替卡韦在乙肝中的治疗效果及其对免疫细胞的功能影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(104):11-13+24.
Cuative Effect of Entecavir on Hepatitis B and Influence on Immune Cell Function
SI Jin-mei 1,WANG Qian 2,CHEN Min 1,XU Xiao-guo 1,LI Qing-qing 1
(1.Shuyang County People's Hospital of Jiangsu,Shuyang,Jiangsu,223600;2.Jiangsu People's Hospital,Nanjing,Jiangsu,210000)
ABSTRACT：Objective To study curative effect of entecavir on hepatitis B and function of immune cells.Methods Choose 74 cases hepatitis B patients in hospital from December 2016 to December 2017 as observation group,and 24 cases healthy persons at same period as control group.All cases of observation group were treated with entecavir orally for 48 weeks;take peripheral blood twice before treatment and 48 weeks after,detect immune function biochemical indexes of all cases with automatic biochemical analyzer,chemiluminescence analyzer,RT-PCR and flow cytometry and ELISA;take same amount of peripheral blood in control group and detect CD4+CD25+Treg,Treg and cytokines level.Carry on statistical analysis on data with SPSS16.0 software.Results After entecavir treatment,ALT,AST,HBeAg,HBV DNA in observation group was significantly lower than before treatment(P<0.01),HbsAg showed no significant difference between before and after treatment,(P>0.05);CD4+CD25+Treg and Treg of peripheral blood in observation group before treatment was significantly higher than control group(P<0.05).After treatment,CD4+CD25+Treg and Treg levels in peripheral blood of observation group were significantly lower than before treatment(P<0.05);cytokines level was significantly higher than before treatment,IFN–γlevel was significantly increased and IL-10 level significantly decreased,both were higher than control group.Conclusion CD4+CD25+Treg,Treg level in peripheral blood of hepatitis B patients was significantly increased,and serum IFN-γand IL-10 level was increased.Entecavir treatment can reduce ALT,ASTlevel,improve liver function,reduce contents of HBeAg and HBV DNA,reduce CD4+CD25+Treg level,Treg and IL-10 in peripheral blood significantly,and improve cellular immune function of hepatitis B patients.
KEY WORDS：Entecavir;Hepatitis B;Immune cells;Liver function
0引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染如今已成为全世界面临的一个严重健康问题，据估计在世界范围内感染乙肝病毒者约有20亿人，中国HBV携带者群体占全球约24.67%[1]。导致肝炎反复发作的原因主要是HBV在肝脏器官内的连续存在和不断复制，进一步可发展为肝纤维化和肝硬化甚至肝细胞癌。在现代医学中，乙型肝炎的发病机制被认为主要是免疫功能失调，引起机体免疫功能特异性损伤，尤其以细胞毒性T淋巴细胞（CTL）导致的损伤为主[2]。已知在HBV感染结局中Th1/Th2细胞平衡起到非常关键的作用。常见的IFN-γ、TNF-α等属于Th1型细胞因子，IL-4、IL-10等则属于Th2型细胞因子[3]。在HBV感染者体内，CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Treg）发挥着良好的抑制免疫作用，对HBV的持续性感染有着保持或是促进的作用，在HBV慢性感染和肝病的发生与发展当中也有重要参与[4]。截至目前，已经取得了很好的疗效在抗HBV治疗方面。作为一种环戊基脱氧鸟苷类似物，恩替卡韦（ETV）能够选择性抑制HBV-DNA聚合酶，对于刚开始乙肝病毒DNA的复制有很好的抑制性效用，与此同时还能延长逆转录负链及正链，这也促使其成为应用于临床的第一线药物，在抗乙肝病毒的治疗上积极发挥作用[5-6]。2016年12月至2017年12月，我们对使用给予恩替卡韦的乙肝患者治疗效果进行评价。分别对治疗前后学清肝功能指标ALT、AST，病毒学标志物HBeAg、HBsAg和HBVDNA，以及免疫细胞功能指标Treg、IFN-γ、IL-10等进行分析评价，探讨恩替卡韦的免疫调节作用药理机制，评估恩替卡韦在抗病毒疗效和免疫治疗方面提供新的思路。
1研究资料及方法
1.1研究对象。随机选择2016年12月至2017年12月于医院就诊74例HBV感染者作为观察组，其中男49例、女25例，年龄18-65岁。研究对象纳入准则：①抽取血液后经血清学检查且明确确诊，均诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南2010》[5-7]制定标准以及抗病毒指征；②研究中所有的受试者及患者家属之情了解，且自愿签署知情同意书，对本次的研究内容及相关注意事项有充分的了解；③排除所有合并其他类型肝炎病毒感染者，排除因服用药物、意外中毒或机械损伤等原因所致的肝损伤者，排除在参加本次研究之前的６个月时间内，有曾使用过抗病毒药物、激素等可能存在影响机体免疫系统药物的所有患者。同事设置健康对照组，随机选取同时期医院体检中心24名健康志愿者，包括男17名、女7名；年龄18-65岁，且观察组与对照组之间性别和年龄的差异无统计学意义。本次研究经医学伦理会批准。
1.2研究方法。观察组给予恩替卡韦0.5 mg（百时美施贵宝，国药准字：H20052237），每天服用1次即可，持续用药48周，在此期间，患者皆不予以免疫调节和抗病毒的治疗。对照组服用等量安慰剂，采集空腹肘静脉血4 mL。由同一组的工作人员，分别于治疗前、服药疗程结束后抽取所有观察组患者5 mL空腹肘静脉外周血液，对血样进行部分离心，后吸取血清放于-80℃恒温条件下保存待用。操作人员对研究对象的血清ALT、AST两个生化指标的检测，均使用全自动生化分析仪测定，抗原HBsAg、HBeAg的测定，采用化学发光分析仪检测，HBVDNA含量通过RT-PCR技术检测，CD4+CD25+Treg、Treg应用流式细胞术检测，研究对象的血清细胞因子IFN-γ水平、IL-10水平均用ELISA试剂盒测定。
1.3观察指标与检测方法
1.3.1观察指标
（1）分别在治疗前以及药物疗程结束后，采取观察组清晨空腹肘静脉血5 mL，其中3 mL血样放置在常规促凝管，经离心后抽取其上清液体，以用于进行血清ALT、AST、HBsAg、HBeAg、HBVDNA等五项指标的检测，进行疗效的判断。
（2）而对于研究对象细胞因子水平的测定（血清IFN-γ、IL-10），则用于评价研究对象的免疫细胞功能的变化；操作中，对观察组剩余的2 mL血样，均置于EDTA抗凝血，以供CD4+CD25+Treg、Treg的检验测定。实验操作严格规定在24小时内全部完成。此外，对照组同样取清晨空腹条件下的，肘静脉血4 mL，取其中2 mL血样放置在常规促凝管，并离心吸取上清，稍后进行IFN-γ和IL-10水平的进一步测定；另外剩余的2 mL血样均放入EDTA做抗凝血处理，并于24 h之内完成其CD4+CD25+Treg、Treg的检测工作。
1.3.2检测方法。所有研究对象均统一使用校准后的同一组全自动生化分析仪，以此为前提条件开展对ALT、AST水平的检测。并以相同条件的酶标分析仪为基础，对选取样本当中的HBV血清标志物HBsAg及HBeAg进行检测。同组罗氏荧光定量PCR分析仪则开展对全部样本当中的HBVDNA水平检测。
（1）外周血CD4+CD25+Treg、Treg检测具体方法：选用100μL EDTA抗凝全血，同组实验室人员的操作为前提，分离处理淋巴细胞，得到外周血单核细胞（PBMC）。之后以此加入到10μL FITC标记的抗人CD4抗体中、Per-CP标记的抗人CD25抗体中，放置在常规室温下即可、但要注意避光，在此环境下孵育20 min；孵育完成后、获得的样本皆加入2 mL的溶血素，同样在室温避光放置10 min；采用250 r/min的转速，匀速做样本的离心处理、离心时间为10 min，目的是将上清液去除掉，之后重悬于PBS里（剂量为2 mL），继上述操作之后、于常规室温下以250 g×10 min的条件再次做离心处理，将上清液去除掉；取10ulPE标记的抗人FOXP3抗体，加入到全部样本当中，至结束了漩涡震荡，再予以重悬于PBS中（剂量为2 mL）；之后于常规室温下、以每分钟500 r的速度做匀速离心处理，离心时间为5 min，将上清液去除掉，然后再以同样的条件重复离心处理1次，第二次去除掉上清，最后再重悬于PBS中（剂量为300μL）；操作采取流式细胞仪计数CD4+CD25+Treg、Treg，计算得到其占淋巴细胞的百分比，所得结果代表着CD4+CD25+Treg、Treg水平。
（2）统一使用有效期内的ELISA（北京四正柏）试剂盒检测其血清IFN-γ和IL-10水平，具体实验步骤如下。在检测之前，所有的样品进行1:1的比例缓慢稀释，首先是要把试剂盒取出来，在常规室温下放置一段时间、起到平衡温度的作用，同时进行标准孔与检测孔的设置，具体操作方法是：在孔中加进剂量为100μl的标准品（或是样品），取膜进行密封，放置在37℃的恒温条件下进行孵育，孵育的时间为90分钟；舍弃掉液体，借助于吸水纸的使用将其拍干，把做好生物素标记的IFN-γ和IL-10加入其中，在37℃的条件下再持续孵育60 min；将存在的反应液去除掉，进行4次洗板，彻底将孔中残留的清洗液拍干之后，再掺进辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，同样是在37℃的恒温条件条件下进行孵育，时间为30 min；之后反复进行5次的洗板，并在孔中加入TMB底物溶液，通过20 min的温浴来促进蓝色产物生成，观察到有生成后、立即停止反应，并迅速在450 nm处测定OD值（5 min内完成）。最后经过标准曲线计算出的数值乘以稀释倍数即为血清IFN-γ和IL-10浓度。
1.4统计学处理。本研究使用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，所有研究得到的计量数据、用±s表示，并用t来完成检验，若得到的结果P<0.05的，即为统计学有意义。
2结果
2.1乙肝治疗中使用恩替卡韦的效果。经48周的治疗，观察组血清ALT和AST水平显著低于治疗前（P=0.0022和P=0.0004）；观察组HBV血清标志物HBeAg在恩替卡韦治疗较治疗前显著降低（P=0.0015），但治疗前与治疗后相比，HBsAg水平无显著性差别（P=0.568）；观察组在口服恩替卡韦48周疗程后，HBVDNA与治疗前相比，其表达显著下降（P=0.0008），见表1。
2.2组间静脉血CD4+CD25+Treg、Treg水平差异的对比。均借助于流式细胞仪完成检测，对其静脉血CD4+CD25+Treg、Treg进行计数，CD4+CD25+Treg、Treg各自占淋巴细胞百分率得到计算结果、该结果代表的是CD4+CD25+Treg、Treg水平。结果显示观察组在接受恩替卡韦治疗前，CD4+CD25+Treg和Treg水平均较对照组显著升高（P=0.0013和P=0.000002）；口服恩替卡韦、经治疗后，观察组CD4+CD25+Treg和Treg水平相较于治疗前的水平已经有了大幅度的降低（P=0.0003和P=0.0005），见表2。
2.3两组血清免疫细胞因子水平变化情况。血清细胞因子水平通过ELISA试剂盒进行检测，观察组在给予恩替卡韦治疗前其IL-10水平显著高于对照组（P=0.0005），IFN-γ水平也有所升高但无统计学差异；观察组在给予恩替卡韦治疗后，IFN-γ水平较治疗前相比显著升高（P=0.0008），IL-10水平逐渐降低，但无统计学差异；无论是治疗前还是治疗后，观察组患者测得IFN-γ和IL-10水平皆是要比对照组高的，见表3。
3讨论
HBV感染导致的肝损伤程度不是由病毒本身决定，主要是由宿主免疫系统决定。先天性免疫（主要是自然杀伤细胞和干扰素）诱导一个非特性反应，适应性免疫系统（包括抗体以及CD4+和CD8+淋巴细胞）则负责更具体和强大的应答[7-8]。现有的研究发现，当体内免疫细胞/免疫分子对病毒感染的细胞进行攻击导致免疫病理损伤受到抑制，该损伤会减弱，但病毒复制会增强。因此，在评价药物对乙肝的治疗效果时，除了观察其对肝脏功能的改善外，还需要就其对机体免疫功能的影响进行评估。
目前抗HBV治疗已经取得很好的疗效，目前可用的抗HBV疗法由干扰素和核苷类试剂组成[8]，例如拉米夫定，阿德福韦酯，替诺福韦和恩替卡韦[9]。本次研究我们选用的是恩替卡韦，一种环戊基脱氧鸟苷类似物。其药理机制为：恩替卡韦磷酸化后具有活性，与HBV多聚酶天然底物竞争性的对HBV多聚酶启动加以有效抑制、合成HBVDNA正链，同时形成前基因组mRNA逆转录负链，在上述综合作用下起到对HBV复制的良好抑制效用。其与之前的张弦等、袁宇慧等人几项研究结果一致[10-16]，本次研究中观察组在治疗前其ALT和AST较正常值升高了约4倍，提示肝细胞坏死造成一定程度肝损伤。在48周疗程结束后，观察组服用恩替卡韦者血清ALT和AST水平较治疗前显著降低，下降至40 U/L以下的正常范围内，肝细胞坏死及损伤减轻，肝功能得到显著改善；血清标志物HBeAg以及HBVDNA水平相比于治疗前显著降低，但HBsAg治疗前后水平未见显著性差异。以上结果表明，恩替卡因HBV有抑制作用，可使患者在生化指标、病毒学和组织学等多个方面有所改善。
有研究报道提出这样的说法：在对CD4+和CD8+T细胞的增殖反应上、其杀伤作用的发挥上，CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）都有着重要的参与，同时也在维持机体对抗原（自身/外来）免疫耐受中以抑制方式发挥作用，即通过与其他细胞直接接触或分泌细胞因子的方式。乙肝患者的机体内环境本就有着免疫功能紊乱的问题，而同时考虑到CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Treg、Treg）是发挥着免疫抑制效用的，加之于CD4+CD25+Treg上有着叉头状螺旋转录因子（FOXP3）的主要表达，所以也就预示着其和Treg的功能有着紧密的关联，它的异常可能会产生免疫耐受[13-15]。在Franzese等人的研究中，结果表明CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在HBV的感染进程当中，会特异性的作用于对HBV特异性抗原CD8+T细胞功能的下调，由此可见，因为HBV感染者机体免疫系统功能是受到抑制的、所以无法作用于对病毒的彻底清除。HBV基因产物可能通过抗原识别持续诱导Foxp3表达和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的功能。韩捷等研究发现，患者体内CD4+CD25+Treg比例高于正常，我们的研究结果显示，乙肝患者在治疗前其静脉血CD4+CD25+Treg和Treg与对照组相比显著升高，当给予采用恩替卡因治疗、且经过48周的治疗之后，可以观察到研究对象机体当中的静脉血CD4+CD25+Treg和Treg是要比治疗前有大幅度降低的。这些结果提示，恩替卡韦抗病毒活性以及其磷酸化后抑制HVB复制并减少病毒数量，降低其基因产物对Foxp3表达的诱导并抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的功能，恢复针对HBV特异性抗原CD8+T细胞的功能，有效清除病毒改善肝功能。总结这几年来的实验研究结果，可见在HBV的清除当中，Th1和Th2细胞都是非常重要的参与因子，而随着其发生平衡失调的问题，则会直接造成患者发生HBV感染慢性化的局面[16]。IFN-γ、TNF-α等包含于Th1型细胞因子，IL-4、IL-10等包含于Th2型细胞因子，若Th1/Th2>1，趋于发生急性自限性HVB感染；而Th1/Th2<1，则趋于慢性感染发生。在本次研究中，我们检测所有受试者治疗前后IL-10和IFN-γ水平，结果证实乙型肝炎患者存在比例失衡（Th1/Th2），IL-10和IFN-γ表达水平以Th2占优势，也因此奠定了机体细胞免疫功能降低的基础，使得无法有效清除掉病毒，而乙肝病毒也会持续性的感染。使用恩替卡韦介入治疗，研究结果显示Th1/Th2升高，转换为Th1优势应答，细胞免疫功能加强。
已知与干扰素相比，核苷类药物的抗病毒作用较强且无不良的副作用。核苷类药物每日口服一次给药的治疗方案更容易被接受。其次，之前存在核苷类药物（拉米夫定，阿德福韦，替比夫定）由于其较高的抵抗率被弃用，但如今恩替卡韦已在很大程度上克服了高抵抗性以及具有高抗病毒的能力。
综上所述，恩替卡因对乙肝的疗效较为显著，患者ALT、AST、HBeAg、HBVDNA显著降低；增强细胞免疫，治疗后外周血CD4+CD25+Treg和Treg较治疗前降低且患者由Th2转换为Th1优势应答。
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