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摘要：目的通过检测Tomm34在宫颈癌中的表达情况，探讨其在宫颈癌中的作用及意义。方法采用qRT-PCR、Western Blot技术检测69例宫颈癌及配对癌旁正常子宫颈组织中Tomm34的mRNA及蛋白含量的表达水平，采用免疫组化SP法检测Tomm34的表达，分析Tomm34在宫颈癌中的表达水平与临床病理参数的关系。结果子宫颈癌中Tomm34的蛋白表达水平高于相应癌旁正常宫颈组织；子宫颈癌中的Tomm34 mRNA相对表达量高于配对癌旁组织（P<0.05），差异有统计学意义；子宫颈癌中的Tomm34阳性率（52.2%）高于相应癌旁正常子宫颈组织（14.5%），差异有统计学意义（P<0.05）。Tomm34 mRNA的表达水平与FIGO分期、病理类型、分化程度相关（P<0.05），与绝经、淋巴结转移、肿瘤大小、肌层浸润深度无关（P>0.05）。结论Tomm34可能在宫颈癌的发生发展中发挥至关重要作用，有望成为宫颈癌治疗的潜在靶点。
关键词：宫颈癌；Tomm34；qRT-PCR；Western Blot；免疫组化
本文引用格式：石岩玉,赵书君,任红艳.Tomm34在宫颈癌中的表达及意义[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(86):19-21.
Expression and Significance of Tomm34 in Cervical Cancer
SHI Yan-yu,ZHAO Shu-jun*,REN Hong-yan
（The third affiliated hospital of zhengzhou university,Zhengzhou Henan）
ABSTRACT:Objective To investigate the role and significance of Tomm34 in cervical cancer by detecting its expression in cervical cancer.Methods The mRNA and protein levels of Tomm34 in 69 cases of cervical cancer and normal adjacent cervical tissues were detected by qRT-PCR and Western Blot,and the expression of Tomm34 was detected by immunohistochemical SP method,and the relationship between the expression level of Tomm34 in cervical cancer and clinicopathological parameters was analyzed.Results The protein expression level of Tomm34 in cervical cancer was higher than that in the normal cervical tissue adjacent to the corresponding cancer.The relative expression level of Tomm34 mRNA in cervical cancer was higher than that in para-cancer tissues(P<0.05),and the difference was statistically significant.The positive rate of Tomm34 in cervical cancer(52.2%)was higher than that in the adjacent normal cervical tissues(14.5%),and the difference was statistically significant(P<0.05).The expression level of Tomm34 mRNA was correlated with FIGO stage,pathological type and differentiation degree(P<0.05),but was not correlated with menopause,lymph node metastasis,tumor size,and muscle invasion depth(P>0.05).Conclusion Tomm34 may play a crucial role in the occurrence and development of cervical cancer and is expected to be a potential target for the treatment of cervical cancer.
KEY WORDS:Cervical cancer;Tomm34;qRT-PCR;Western Blot;Immunohistochemical
0引言
子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，宫颈癌的发病逐渐趋于年轻化趋势[1]。早期宫颈癌以手术为主，但晚期宫颈癌患者失去手术时机，只能选择放化疗的治疗方式[2]。肿瘤的发生发展与线粒体功能失调密切相关[3]，包括DNA序列的改变、线粒体蛋白及分子结构的改变、能量代谢活动的不同等。线粒体外膜34（Tomm34）的转位酶是是线粒体外膜转位酶家族的成员之一，同时是HSP70/HSP90的共伴侣样蛋白[4]，对于线粒体为细胞提供足够能量发挥着重要的作用[5]，发现其在结肠直肠癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、膀胱尿路上皮性癌、浸润性乳腺癌中过表达，与不良预后有关。关于Tomm34在宫颈癌中的研究少。因此，本研究的目的是研究Tomm34在宫颈癌中的表达谱，同时阐述与临床病理指标的关系。
1资料与方法
1.1一般资料
收取郑州大学第三附属医院2017年10月至2019年03月行宫颈癌根治术的新鲜癌组织及配对癌旁正常宫颈组织共69例，患者年龄29-68岁，平均（42.8±7.9）岁。其中17例为低分化，38例为中分化，14例为高分化；按FIGO 2009年临床分期标准：IA期8例，IB期33例，IIA期28例，有淋巴结转移者7例，无淋巴结转移者62例，宫颈鳞癌46例，宫颈腺癌23例。纳入标准：（1）术前未经过放、化疗；（2）患者无其他恶性肿瘤、经病理证实为宫颈癌；（3）无严重器质性疾病、可耐受手术；（4）所有患者均知情同意；所有病理结果均经2名以上病理医师确诊，石蜡标本由我院病理科保存，新鲜宫颈标本于-80℃冰箱中进行冻存；本实验经我院伦理委员会批准。
1.2试剂
兔抗人Tomm34多克隆抗体、免疫组织化学检测试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。Western blot化学发光液购于美国CST公司，BCA蛋白定量试剂盒购于上海信帆生物科技有限公司。Tomm34正向引物:5'-TAC-GTACGTACTCAGATGG-3';反向引物:5'-TC-AGCGAGGCAGTAGTCG-3'；内参GAPDH正向引物:5'-GTAGCTGATGATCCGAGTC-3';反向引物:5'-GTAGACGGAGATGCGATGTC-3'均由上海生物工程有限公司合成。RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司。
1.3方法
1.3.1免疫组化SP法检测Tomm34表达阳性率
步骤：将石蜡包埋组织标本制成3 um切片，在二甲苯脱蜡、无水乙醇水化。按试剂说明书操作，Tomm34和β-catenin一抗浓度均为1：500，以PBS取代一抗作为阴性对照。抗原修复液（PH6.0的枸橼酸缓冲液）中修复，室温孵育15分钟，滴加一抗4℃湿盒中过夜，PBS冲洗3次后，加入二抗室温孵育20分钟，加入新鲜配制的DAB显色液，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，使用二甲苯脱水，中性树胶封片，置于显微镜下观察。
结果判定标准：在高倍显微镜下观察包膜或包浆中若出现黄色或棕黄色颗粒物质可视为阳性，根据染色强度、阳性细胞染色率来进行免疫组织化学染色评分：无着色0分，淡黄染1分，棕黄色2分，棕褐色3分；每个高倍镜视野计数100个细胞，随机选取10个视野进行计数，取平均值作为阳性细胞数，以阳性细胞数百分比计分：<10%为0分，10%-50%为1分，51%-75%为2分，≥75%为3分；最后将染色强度与阳性细胞率评分作乘积分级：2-3分为弱阳性（+），4-6分为中阳性（++），7-9为强阳性（+++），≥（+）均为阳性表达。免疫组织化学染色结果至少由2位病理诊断医生进行双盲判定。
1.3.2Tomm34的mRNA相对表达量检测
采用qRT-PCR法。取100 mg冻存组织,液氮的研钵中研磨,Trizol试剂提取总mRNA。用紫外光分光光度计测定并计算mRNA的浓度和纯度,，同时评估mRNA的完整性。按照RT-PCR试剂盒说明书，将合格的mRNA样品反转录成cDNA,逆转录反应体系为25uL，取cDNA2uL为模板进行PCR扩增，反应体系为20uL。Tomm34正向引物:5'-TAC-GTACGTACTCAGATGG-3';反向引物:5'-TC-AGCGAGGCAGTAGTCG-3',扩增片段长度123 bp。内参GAPDH正向引物:5'-GTAGCTGATGATCCGAGTC-3';反向引物:5'-GTAGACGGAGATGCGATGTC-3',扩增片段长度225bp。反应条件:95℃8分钟预变性，95℃变性15秒，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环。实验按照2-△△Ct方法处理数据。实验重复3次，结果取平均值。
1.3.3Tomm34的蛋白表达量水平的检测
采用Western Blot法。用BCA蛋白定量试剂盒定量，取40 ug蛋白，配制浓缩胶、分离胶，将制好的胶固定在电泳槽上，进行电泳，之后将蛋白电转至PVDF膜上。封闭液浸泡PVDF膜，封闭12小时，将PVDF膜置于封闭液稀释的一抗中(抗体浓度稀释为1:1000，4℃孵育过夜)、封闭液稀释的二抗孵育液中(1:5000稀释，37℃孵育2 h)、洗去多余的二抗后，膜上覆盖适量化学发光显色液，并置于BandScan凝胶成像系统中成像、拍照。
1.4统计学方法
数据分析采用SPSS 24.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1Tomm34在宫颈癌及相应癌旁正常宫颈组织中的表达水平
Tomm34在宫颈癌中的阳性表达率为52.2%（36/69），在相应癌旁正常宫颈组织的阳性表达率为14.5%（10/69），差异有统计学意义（2=22.043，P=0.000）（见表1）。
2.2两组Tomm34 mRNA表达水平比较
宫颈癌及配对癌旁组织的Tomm34 mRNA相对表达量分别为3.876±1.513、1.005±0.639(t=13.098，P<0.05)，差异有统计学意义。
2.3Western Blot检测在宫颈癌及配对癌旁组织的Tomm34蛋白表达含量情况。
相对于正常宫颈组织，Tomm34在宫颈癌中的蛋白是呈高表达的（见图2）。
2.4Tomm34在宫颈癌中的表达
与FIGO分期、分化程度、病理类型有关（P<0.05），而与绝经与否、肿瘤大小、淋巴结转移、肌层浸润深度无关（P>0.05）。
3讨论
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，很大程度上威胁者女性的身心健康。近年来，随着宫颈癌筛查的推广，早期新发病例的比例呈现上升趋势[6]。早期宫颈癌的治疗原则是以手术治疗为主；晚期宫颈癌以放疗、化疗为主。但放化疗的近远期不良反应有时严重影响患者的生存质量，因此，有必要寻找宫颈癌潜在治疗靶点。Tomm34（线粒体外膜转位酶34）位于20q13.12染色体[7]，由309个氨基酸组成，是线粒体外膜转位酶家族成员之一，主要存在于细胞质中，其作用是将胞质中的蛋白质转入至线粒体中，发挥转运蛋白的作用，并且是参与蛋白质折叠的细胞伴侣系统。研究表明，Tomm34是HSP70/HSP90共伴侣蛋白，并且修改二者的蛋白质折叠活性。正常状态下，热休克蛋白（HSP）基因处于静息状态，在缺氧、缺血、炎症反应下、恶性肿瘤等有害刺激情况下，热休克蛋白基因被激活迅速合成热休克蛋白，以保护机体自身免受伤害。王斌[8]等研究表明，HSP70的表达与肿瘤的直径是呈正相关的，肿瘤直径的大小反应了肿瘤的增殖状态，因此，推测HSP70促进肿瘤的发生发展可能与热休克蛋白促进肿瘤细胞增殖以及发挥抗凋亡作用有关。抑癌蛋白p53是HSP70、HSP90的底物蛋白，大多数的肿瘤细胞中可发现p53的突变。在正常状态下，抑癌蛋白p53与HSP90形成分子伴侣复合物，短时间内可维持抑癌蛋白p53活性。但在肿瘤细胞中，过表达的热休克蛋白与抑癌蛋白进行异常相互作用且结合的持续时间延长，从而抑制p53蛋白的降解。除此之外，端粒酶、表皮生生长因子受体、蛋白激酶B等也是热休克蛋白90的底物蛋白，这些底物蛋白的异常调控或者突变会直接影响细胞代谢、细胞凋亡、细胞增殖等功能的正常进行。
癌细胞因其快速增殖而需要高水平的蛋白质合成，导致癌细胞缺乏氧气、必需营养素，许多应激诱导的蛋白质会被上调，其中包括伴侣蛋白HSP70和HSP90,靶向线粒体蛋白伴侣蛋白和异常线粒体功能是一种有前景的癌症治疗策略[9]。Aleskandarany等[10]通过检测Tomm34在乳腺癌中的表达情况，发现Tomm34的表达水平与不良预后有一定关联，如肿瘤大小、淋巴结分期、肿瘤分级、分化程度、淋巴血管的侵袭性；Shimokawa等[11]发现在结直肠癌中，在侵袭性结直肠癌中被上调，当该基因被小干扰RNA阻断时细胞增殖、生长受到抑制，其被认为与肿瘤生长相关；Ahamed[12]等发现Tomm34在膀胱上皮性浸润性癌中的表达与高肿瘤分期、肌层浸润、高分级有关。增加分子伴侣的活动是癌症和抗Hsp90的或抗Hsp70的治疗剂的普遍特征正在研究用于治疗各种癌症类型Junichiro Kawamura等[13]发现针转移性结直肠癌患者，肽疫苗由环指蛋白43(RNF43)和线粒体外膜34转位酶（Tomm34）组成，细胞毒性Ｔ淋巴细胞的免疫应答证实为疫苗接种的有效指标。
本实验研究采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western Blot技术分别检测Tomm34在宫颈癌及配对癌旁正常宫颈组织中Tomm34的表达情况，并分析与临床病理参数的关系。实验结果表明，Tomm34在宫颈癌组织中呈现高表达状态，阳性率达52.2%，相应配对癌旁正常宫颈组织中的Tomm34阳性表达率仅为14.5%，两者比较差异有统计学意义（2=22.043，P=0.000）。Western Blot结果显示，宫颈癌组织中表达Tomm34蛋白，配对癌旁正常宫颈组织明显低于宫颈癌组织中的蛋白表达量。qRT-PCR结果提示：宫颈癌组织中的Tomm34 mRNA表达水平高于正常宫颈组织中Tomm34mRNA水平。进一步统计分析发现，Tomm34在宫颈癌中的表达与高FIGO分期、分化程度及病理类型有关（P<0.05），而与绝经与否、肿瘤大小、淋巴结转移、肌层浸润深度无关（P>0.05）。晚期宫颈癌患者失去手术机会，以放化疗为主的治疗方式，其副作用及对患者造成的生理伤害及心理负担较大，因此迫切需要开发新型治疗剂。本研究初步证实Tomm34的表达与宫颈癌密切相关，Tomm34在宫颈癌中的表达谱暗示其有促肿瘤作用、与不良预后有关，可能作为宫颈癌的潜在治疗靶点。
参考文献
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