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摘要：目的观察红芪多糖（Hedysarum Polybotys Saccharide，HPS）对糖尿病大鼠视网膜Nrf2、SOD、iNOS表达水平的影响，并探讨其机制。方法用60μg/g一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型。将糖尿病模型大鼠分为模型对照组（DM）、红旗多糖治疗组（HPS），另设正常对照组（NC），每组10只。均灌胃给药，1 d/1次，HPS组给予相应药物，DM组和NC组给予等剂量生理盐水，分别喂养12周。在12周后采用HE染色观察视网膜形态，免疫组化法观察细胞凋亡情况，和PCR方法检测Nrf2、SOD、iNOSmRNA表达。结果与NC组对比，DM组与HPS组视网膜SOD含量下降，iNOS、Nrf2的表达增加（P<0.05）。与DM组对比，HPS组的Nrf2、SOD的表达增加（P<0.05），iNOS表达明显降低（P<0.05）。结论HPS对DM大鼠视网膜有保护作用，推测其机制可能是通过作用于Nrf2-ARE通路，增加SOD含量，降低大鼠视网膜中iNOS含量，减轻氧化应激反应，从而保护视网膜。
关键词：糖尿病视网膜病变；红芪多糖；Nrf2；iNOS；SOD
本文引用格式：李琰,周亚男,李猛,等.红芪多糖对糖尿病大鼠视网膜的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(74):112+114.
0引言
糖尿病视网膜病变是糖尿病患者常见的并发症之一，是致盲的主要原因[1]。近年来，许多学者认为DR主要病理过程与氧化应激水平密切相关，SOD为内源性抗氧化物，机体维持处于氧化与抗氧化的动态平衡之中[2]。iNOS为诱导型NOS，在病理因子诱导下可大量表达催化形成过量NO发挥细胞毒效应。Kelch样ECH联合蛋白1-核转录因子E2相关因子2（Keap1-Nrf2）信号通路是调控细胞氧化应激水平的关键通路，该通路可调控多种靶基因的表达，直接影响机体的氧化应激水平[3-4]。HPS通过作用于Nrf2-ARE通路，使机体抗氧化能力增强，从而减少NO含量，减轻细胞毒性，抑制细胞凋亡，保护视网膜。
1资料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物：清洁级健康雄性SD大鼠30只，体质量200-240 g，标准饲料喂养，实验前适应性喂养1周。
1.1.2主要试剂：链脲佐菌素（STZ），红芪多糖血糖测定采用美国强生公司血糖仪。兔抗大鼠Nrf2、SOD、iNOS多克隆抗体；提取RNA试剂盒、逆转录试剂盒等。
1.2实验方法
1.2.1造模：随机选取20只大鼠，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ，72 h后尾静脉取血测血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L以上、尿量和饮水明显增多者为糖尿病模型诱导成功。另外10只腹腔注入等量柠檬酸钠缓冲液，72 h后测量空腹血糖均<5.6 mmol/L，设为正常组。
1.2.2分组和给药除正常组：10只大鼠外，将造模成功的20只大鼠按随机数字表法分为模型组和红旗多糖治疗组，每组16只。对照组、模型组给予生理盐水灌胃，治疗组大鼠给予HPS灌胃，连续治疗12周。
1.2.3标本处理：灌胃12周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，断颈处死，摘取眼球。左眼球冰下剥离视网膜组织，液氮速冻，置于EP管中，-80℃冰箱储存备用，右眼置于4%多聚甲醛固定。
1.2.4HE染色：将右眼切除眼前节，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋，连续切片。切片脱蜡，乙醇浸泡，苏木精染色，盐酸乙醇分化，伊红染色，乙醇脱水，中性树胶封片，镜下观察视网膜组织病理学变化。
1.2.5PCR检测Nrf2、SOD、iNOSmRNA表达：按试剂盒说明书提取总RNA，用微量核酸蛋白分析仪计算所得RNA的含量和纯度。取总RNA3µg，按反转录试剂盒说明书进行反转录，以β-actin为内参照进行RT-PCR反应。
1.3统计学分析。应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和LSD-T检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HE染色。NC组视网膜组织各层结构清晰、完整，排列整齐；DM组视网膜外核层疏松变薄、排列紊乱，神经节细胞数量减少；给药组较模型组明显好转。
2.2各组大鼠视网膜中Nrf2、SOD、iNOSmＲNA的相对表达量。PCR检测结果显示，DM组与HPS组较NC组SOD含量下降，Nrf2、iNOS的表达较NC组增加，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；HPS组Nrf2、SOD的表达较DM组增加，iNOS的表达较DM组减少差异均有统计学意义（均为P<0.05），见表1、2。
3讨论
糖尿病视网膜病变是糖尿病一种常见的并发症，糖尿病视网膜病变的发病较为隐匿，一旦出现视力损害，则预后较差。近年来越来越多的研究证实DR是一种与氧化应激密切相关的疾病，糖尿病患者的高血糖状态导致了视网膜组织中氧化应激的过度表达。APS具有抗氧化应激、抗肿瘤、抗炎症反应、免疫调节、抗病毒、预防衰老等作用[5]。APS能够提高SOD的活性，清除氧自由基，通过抗机体氧化应激减少细胞凋亡，从而保护视网膜。
本研究建立糖尿病大鼠模型，长期高血糖状态使得视网膜细胞处于氧化应激的环境。结果发现，糖尿病组较正常组SOD含量下降，说明机体处于过氧化状态，SOD被大量消耗，iNOS、Nrf2均增加，可产生大量NO，从而产生细胞及组织损伤。经红芪多糖治疗后，细胞内Nrf2、SOD含量增加，iNOS含量降低，表明红旗多糖可以通过激活Nrf2抗氧化通路，使抗氧化酶SOD合成增加，从而抑制活性氧的产生，减少iNOS合成，降低NO损伤。综上所述，红芪多糖可以减少过度氧化应激而造成的细胞凋亡，从而减轻糖尿病视网病变，为人类早期干预糖尿病视网膜病变带来福音。
参考文献
[1]金春花,李连喜,李梅芳,等.新诊断2型糖尿病患者视网膜微血管异常的临床特征及危险因素研究[J].中国全科医学,2015,18(5):493-497.
[2]沈烨渠,沈渠深,张秋子.氧化应激与糖尿病血管并发症的关系[J].中国糖尿病杂志,2014,22(9):856-858.
[3]蔡维霞,张军,胡大海.氧化和化学应激的防御性转导通路——Nrf2/ARE[J].中国生物化学与分子生物学报,2009(4):297-303.
[4]杜玉.天然抗氧化剂抗氧化损伤作用及机制[D].山东大学,2009.
[5]杨建华,段俊国.黄芪提取物对体外高糖培养牛视网膜毛细血管周细胞的影响[J].国际眼科杂志,2007(3):685-687.
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