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摘要：目的探讨MLPA技术在中国Peutz-Jeghers综合征患者STK11基因突变检测中的应用价值。方法选取2010年至2019年南方医科大学南方医院消化研究所，31个经Sanger测序未发现STK11基因突变的PJS家系患者作为检测对象，家系中表型正常的31名健康成员及30份家系外健康体检人DNA样本作为对照。取家系中PJS患者、健康成员以及家系外健康体检人员的外周血样本并取外周血DNA，MLPA反应检测Peutz-Jeghers综合征患者STK11基因突变情况。结果应用MLPA技术检测31例Sanger测序未发现STK11基因突变的PJS先证者，结果显示12例（38.7%，12/31）先证者存在STK11基因的大片段缺失，其中7例为1号外显子缺失（c.-1114-?_290+?del），2例为3号外显子缺失（c.375-?_464+?del），1例为3-10号外显子缺失（c.375-?_1365+?del），1例为4-6号外显子缺失（c.465-?_862+?del），1例为6号外显子缺失（c.735-?_862+?del）。携带STK11基因大片段缺失的PJS患者中，发生3例乳腺癌、1例结肠癌、1例胰腺癌和1例宫颈癌。结论MLPA技术和Sanger测序可常规用于PJS患者STK11基因突变检测，两者联合应用明显提高了PJS患者STK11基因突变检出率
关键词：MLPA技术；Peutz-Jeghers综合征；基因突变
本文引用格式：邓秀金,冯洁,赖颖君,等.MLPA技术在中国Peutz-Jeghers综合征患者STK11基因突变检测中的应用[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(71):251,254.
0引言
黑斑息肉综合征（Peutz-Jeghers Syndrome，PJS，MIM#175200）是一种由STK11基因胚系突变引起的以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发错构瘤性息肉为特征的罕见常染色体显性遗传病。STK11(serine threonine kinase 11,MIM#602216)基因定位于人类染色体19p13.3，全长2158bp，由9个外显子组成，编码433个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK11[1]。目前报道的STK11基因突变有400多种，大部分为错义突变、剪切位点突变、无义突变和小的插入/缺失突变。国外研究表明STK11基因突变检出率为66-94%[2]，而目前采用PCR扩增外显子和旁侧有限区域及DNA测序的方法，中国PJS患者STK11突变检出率较低，为52-59%[3-4]。国外学者报道STK11基因中有部分突变可能是跨越外显子的大片段缺失或重复突变[5]，国内尚无系统报道。本研究采用多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA），对中国人群中经Sanger测序未明确STK11基因突变的PJS患者进行分析，了解该基因大片段缺失或重复突变情况。
1资料与方法
1.1临床资料
2010年至2019年南方医科大学南方医院消化研究所，31个经Sanger测序未发现STK11基因突变的PJS家系患者作为检测对象，家系中表型正常的31名健康成员及30份家系外健康体检人DNA样本作为对照。研究中PJS诊断标准[6]即符合以下4条中的任何l条：（1）2个或多个息肉，经组织学诊断符合PJS特点，即起源于黏膜肌层的平滑肌像树枝样延伸至息肉的黏膜下层，称之为PJ息肉；（2）具有PJS家族史且伴有任何数量的PJ息肉；（3）具有PJS家族史且典型的皮肤黏膜色素沉着；（4）典型的皮肤黏膜色素沉着且伴有任何数量的PJ息肉。患者及对照样本的采集均遵循知情同意的原则，并取得南方医科大学南方医院医学伦理委员会审查批准。
1.2实验方法
取家系中PJS患者、健康成员以及家系外健康体检人员的外周血样本，采用上海生工生物工程技术服务有限公司SK1261试剂盒提取外周血DNA。MLPA试剂盒SALSA P101-B1 STK11购自MRC-Holland公司，按照试剂盒操作说明完成MLPA反应[3]。MLPA反应产物用ABI3500DX测序仪进行毛细管电泳，结果采用MRC-Holland公司开发的MLPA数据分析专用软件Coffalyser进行分析。拷贝数根据电泳峰面积比值进行判定：正常2拷贝的比值比参考范围为0.85-1.15，比值比0.35-0.65判断为杂合缺失突变，比值比1.35-1.65判断为杂合重复突变。
2结果
应用MLPA技术检测31例Sanger测序未发现STK11基因突变的PJS先证者，结果显示12例（38.7%，12/31）先证者存在STK11基因的大片段缺失，其中7例为1号外显子缺失（c.-1114-?_290+?del），2例为3号外显子缺失（c.375-?_464+?del），1例为3-10号外显子缺失（c.375-?_1365+?del），1例为4-6号外显子缺失（c.465-?_862+?del），1例为6号外显子缺失（c.735-?_862+?del）。MLPA检测家系其他PJS患者和正常成员，提示STK11基因大片段缺失与家系表型共分离。研究发现，携带STK11基因大片段缺失的PJS患者中，发生3例乳腺癌、1例结肠癌、1例胰腺癌和1例宫颈癌（表1）。
3讨论
STK11基因突变被证实是PJS的主要致病原因，但仍有部分符合PJS诊断标准的患者并未检测出STK11基因突变，可能与当前的检测技术有关、也可能存在STK11基因以外的致病原因，目前尚无定论。但MLPA检测技术在PJS患者STK11基因突变筛查中非常重要，能够提高STK11基因突变检出率。
MLPA技术是建立在DNA探针杂交和PCR技术基础上的针对待测核酸中靶序列进行定性和半定量的高通量分析技术。仅需少量的DNA，通过变性、探针杂交、连接和扩增等过程，检测数十个核苷酸序列的拷贝数变化，通过软件进行定量分析。根据相应探针信号值的改变可以判断靶序列是否有点突变或拷贝数异常。STK11基因MLPA检测试剂盒包括12个STK11基因序列的探针（1号外显子设3个探针，其他8个外显子各设1个探针，另外一个探针为3’端非编码区）和9个其他限定染色体区域为对照的探针，此外还包括位于0.6MB和0.9MB端粒区的4个探针、位于10MB着丝粒的一个探针。
本研究对31例经外显子Sanger测序后未发现STK11基因突变的PJS患者进行MLPA分析，检测到12例（38.7%）STK11基因大片段缺失，并与家系表型共分离。国外研究报道应用MLPA技术检测到STK11基因大片段缺失率约为13%-39%[3,5,7,8]，证实MLPA技术和Sanger测序可常规用于PJS患者STK11基因突变检测，两者联合应用明显提高了PJS患者STK11基因突变检出率。此外，本研究发现的12个STK11基因大片段缺失中，7个（58.3%，7/12）为Exon1缺失，提示STK11基因Exon1缺失可能是PJS患者突变热点之一，原因可能与Exon1为STK11基因9个外显子中长度最长的一个外显子有关，也可能因该区域是重要的结构功能区。同时，我们还发现STK11基因三种大片段缺失可能与恶性肿瘤相关，包括消化道肿瘤和妇科肿瘤，国人亦有类似报道[9]，这种基因型和表型的关系有待国内外更多的基因检测数据来证实，值得进一步探索致病和致癌机制。
参考文献
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[8]E Volikos,J Robinson,K Aittomaki,et al.LKB1 exonic and whole gene deletions are a common cause of Peutz-Jeghers syndrome[J].J Med Genet,2006,43:e18.
[9]Hu Tan,Libin Mei,Yanru Huang,et al.Three novel mutations of STK11 gene in Chinese patients with Peutz-Jeghers syndrome[J].BMC Medical Genetics,2016,17:77.
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