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摘要：目的探索自噬在糖尿病大鼠肝脏中的表达及其对糖尿病肝脏损伤的影响。方法将40只SD大鼠随机分为糖尿病组和正常对照组，糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素，正常对照组腹腔注射生理盐水，注射后观察毛发、体重、精神变化，鼠尾采血查空腹血糖水平。模型制备成功后，速取肝脏，一部分10%甲醛固定、流水冲洗、酒精保存留待做HE染色，其余部分放置-80℃冰箱保存，准备做PCR。结果HE染色发现糖尿病大鼠肝脏发生水肿和嗜酸性变；实时荧光定量PCR结果发现：自噬相关基因Atg4b、Beclin1、Bnip3、Vps34在糖尿病大鼠肝脏中的mRNA高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论自噬参与了糖尿病致肝脏损伤的过程。
关键词：糖尿病；肝脏；自噬
本文引用格式：马德菊,王慧慧,王清路,等.自噬相关基因在1型糖尿病大鼠肝脏中的表达[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(66):241-242.
Expression of Autophagy-related Genes in Liver of Type 1 Diabetic Rats
MA De-ju,WANG Hui-hui,WANG Qing-lu,XI Hong-juan
(Qilu Medical College,Zibo Shandong)
ABSTRACT:Objective To explore the expression of autophagy in the liver of diabetic rats and its effect on the liver injury of diabetes mellitus.Methods 40 SD rats were randomLy divided into diabetic group and normal control group.The diabetic group was injected with streptozotocin intraperitoneally and the normal control group was injected with saline intraperitoneally.After the model was successfully prepared,the liver was taken quickly.Some of the liver was fixed with 10%formaldehyde,washed with running water and preserved with alcohol for HE staining.The rest was stored in a refrigerator at-80℃for PCR.Results HE staining showed edema and eosinophilia in the liver of diabetic rats.Real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of autophagy-related genes Atg4b,Beclin1,Bnip3 and Vps34 in the liver of diabetic rats was higher than that of the normal control group(P<0.05).Conclusion Autophagy is involved in the process of liver injury induced by diabetes mellitus.
KEY WORDS:Diabetes mellitus;Liver;Autophagy
0引言
糖尿病是一种常见的由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的内分泌代谢性疾病，其基本病理为胰岛素绝对或相对以及靶细胞组织对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱，分为1型和2型。1型糖尿病是由于胰岛B细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏，2型糖尿病表现为胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对性缺乏或胰岛素分泌受损为主伴胰岛素抵抗。2014年WHO估计全球有4.22亿成人患有糖尿病，其中我国占1/4，预测到2030年糖尿病将成为全球第七大死亡原因[1]。肝脏是糖类、脂类和蛋白质代谢主要的场所，同样也是胰岛素作用和胰岛素分解代谢的重要部位，糖尿病患者肝脏对糖的利用减少，释放增加，很容易造成脂肪代谢紊乱和脂肪肝，影响肝脏的功能。一方面，糖尿病会导致肝脏损伤[2]，另一方面，肝脏又对糖尿病有重要影响，肝脏可通过糖原的合成与分解来调节葡萄糖代谢，影响糖尿病患者的血糖水平。
自噬是由比利时科学家Christian de Duve上世纪50年代首先发现并提出后[3]，一直都是研究的热门，日本生物学家大隅良典因对细胞自噬作用机制的研究做出杰出贡献而获得2016年的诺贝尔生理学奖，也将自噬的研究推上了新的高度。目前自噬现象在肝脏的研究少见报道，特别是关于糖尿病肝脏的就更少了。本研究借助PCR技术检测糖尿病大鼠肝脏与正常大鼠肝脏中自噬相关基因的表达水平，探讨自噬在糖尿病大鼠致肝脏损伤的机制。
1材料与方法
1.1实验动物、试剂和仪器
选取健康8周龄SD大鼠，雌雄不拘，体重200-250g，由山东济南金丰实验动物有限公司提供，链脲佐菌素(STZ)购于Sigma公司；引物、TRIzol总RNA提取试剂和cDNA合成试剂盒均购自武汉三鹰生物技术公司；qPCR预混液购于碧云天生物技术研究所。
1.2实验动物分组与模型制作
将40只SD大鼠随机分成两组，糖尿病组（DM组，20只）与正常对照组（NC组，20只）。所有大鼠均给予标准饲料、自由饮水，标准笼饲养,每笼5只。将链脲佐菌素溶于0.1mol/L柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液中配成1%STZ溶液。DM组按照65mg/kg的剂量腹腔注射1%STZ溶液，正常组腹腔注射等量的0.1mol/L柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液。所有大鼠完成注射后，给予相同的生活环境和喂养条件。对症状较重的糖尿病大鼠可以腹腔注射胰岛素1~4U/d，以降低死亡率。在注射STZ前及注射后3-7d，大鼠尾静脉采血使用快速血糖仪检测空腹血糖。空腹血糖水平大于16.7mmol/L的大鼠视为1型糖尿病大鼠造模成功。注射前及注射后每天测体重，观察大鼠表现。正常对照组毛发鲜亮，眼睛有神，体重正常并有所增长，无多饮多尿表现。DM组，体重减轻，毛发粗糙，眼球浑浊，精神差并伴有明显的多饮多尿表现。
1.3HE染色
造模成功后2周使用20%氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，按7mL/kg腹腔注射，麻醉成功后，速取肝脏组织。将其中每组5只取出的组织用10%福尔马林固定48h，流水冲洗24h后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5m的薄片，放于60℃热水中展片，并贴到载玻片上烘干。切片常规脱蜡至水，苏木精溶液染色，伊红溶液复染，再经梯度酒精脱水二甲苯透明后用中性树胶封固。
1.4实时荧光定量PCR
按照Trizol说明书提取DM组合NC组肝脏组织总RNA，并检测RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。逆转录过程按qPCR预混液说明书配成20L反应体系，引物序列见表1。反应在普通PCR仪上进行，循环40次。不同引物的反应程序恒温段都为95ºC 20s；Atg4b循环段为：95ºC 15s，54ºC 20s，72ºC 30s。Beclinl循环段：95ºC 15s，62ºC 20s，72ºC 30s。Bnip3循环段：95ºC 15s，55ºC 20s，72ºC 30s。Vps34循环段：95ºC 15s，56ºC20s，72ºC 30s。以β-action引物作为内参校正，恒温段：95ºC 20s；循环时与目的基因一致。以5种基因的2^-△△Ct进行统计学分析。
1.5数据分析
应用统计软件SPSS 17.0做统计分析，定量资料以均数±标准差表(±s)表示，采用配对t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HE染色
HE染色结果显示，肝细胞发生嗜酸性变（图1）、水肿（图2），嗜酸性变散布在肝小叶内，多累及单个或几个肝细胞，肝细胞胞浆水分脱失浓缩，嗜酸性染色增强，胞浆颗粒性消失。肝细胞肿大，细胞核多位于中央区，增大，淡染，胞质疏松、稀少，内含粉红色嗜酸性颗粒。
2.2实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR显示，Atg4b、Beclin1在糖尿病大鼠肝脏中的mRNA高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；Bnip3、Vps34在糖尿病大鼠肝脏中的含量也高于正常对照组，其中Bnip3有统计学差异（P<0.05），Vps34有显著统计学差异（P<0.01）。
3讨论
链脲佐菌素诱导的SD大鼠存在多器官的损伤。除了可以引起心脏、肾脏、视网膜和神经等器官和组织的损害外，还会导致各种类型的肝脏、胰腺和肌肉损伤。以往对糖尿病的研究主要集中在高血糖与血管病变之间的联系方面，对糖尿病的慢性并发症研究也多集中在肾脏、心血管和视网膜方面，很少涉及关于肝脏器官的专门研究。有研究发现糖尿病患者发生肝脏病变可达21%-78%，主要表现为脂肪肝，且糖尿病1型、2型均可发生[4]，跟同年龄同性别的非糖尿病患者相比，约有4/5的糖尿病患者同时存在脂肪肝[5]，而且脂肪肝的出现与血糖控制水平是否正常无关[6]。
自噬广泛参与细胞各种生命活动，其主要功能表现在以下几个方面：（1）通过吞噬受损细胞器、蛋白质、核苷酸等细胞成分，并将其降解为氨基酸、脂肪酸、单核苷酸从而为应激条件下的细胞提供必需能量，抵抗凋亡，帮助细胞在恶劣环境中存活。（2）自噬通过吞噬降解衰老细胞器、大分子及细胞质成分维持细胞稳态，在细胞衰老、肿瘤发生中具有重要意义。（3）自噬能够吞噬线粒体和过氧化物酶体，具有抑制活性氧（ROS）的功能。（4）在细胞无法继续存活的情况下，自噬能够诱导细胞发生凋亡。作为保护细胞自身的一种机制，过弱或者过强的自噬都可能引起细胞的死亡。
目前发现的自噬相关基因(autopahgy related genes，Atg)已达31种。在哺乳动物细胞中Atg4有四个家族成员：Atg4a、Atg4b、Atg4c、Atg4d。Atg4能让Atg8-PE去脂化，促使自噬体与溶酶体融合，参与调控整个自噬过程。自噬发生需要经过自噬小体的形成、自噬小体与溶酶体融合和自噬底物在溶酶体降解等过程。自噬小体的形成是自噬发生和完成的关键调控步骤，它的形成需要满足两个条件：一是定位内质网膜的Vps34激活催化PI生成Pi3p，Pi3p在内质网膜局部的富集造成自噬前体的发生，固Vps34对经典自噬和非经典自噬的启动至关重要[7]。自噬相关基因Atg6在哺乳动物被称为Beclin1，是自噬发生与调控的关键蛋白，可调控自噬前体的形成，引导相关蛋白定位于自噬体膜，并且调节细胞自噬与凋亡之间的平衡[8]。Beclin1可通过激活Vps34来加强自噬过程。Bnip3基因在在缺氧和营养缺乏时可诱导细胞发生程序性死亡，即细胞凋亡，另外，Bnip3还可增强细胞线粒体的自噬能力[9]。研究发现，在转染了Bnip3的细胞中很早就出现了线粒体损害、过多的细胞质空泡和线粒体的自噬现象[10]。本研究发现自噬相关基因Atg4b、Beclin1、Bnip3、Vps34在糖尿病大鼠肝脏中的mRNA高于正常对照组，从而证实自噬参与了糖尿病致肝脏损伤的过程。
综上所述，本研究发现糖尿病肝脏的损伤与自噬有着密切的关系。基于对自噬这种细胞死亡方式的研究能为糖尿病致肝脏损伤的发病提供理论依据。采用药物或基因治疗的手段来抑制自噬，可以阻断相关基因的表达，或是治疗糖尿病的肝脏损伤得一种手段。
参考文献
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[8]Chourasia AH,Tracy K,Frankenberger C,et al.Mitophagy defects arising from BNip3 loss promote mammary tumor progression to metastasis[J].EMBO Rep,2015,16(9):1145-63.
[9]Zhang H,Bosch-Marce M,Shimoda LA,et al.Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia[J].J Biol Chem,2008,283(16):10892-903.
[10]Cleven AH,Wouters BG,Schutte B,et al.Poorer outcome in stromal HIF-2 alpha-and CA9-positive colorectal adenocarcinomas is associated with wild-type TP53 but not with BNIP3 promoter hypermethylation or apoptosis[J].Br J Cancer,2008,99(5):727-33.
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