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摘要：细菌可以靶向定植于肿瘤，随着科技的发展，允许我们像计算机一样处理细菌，运用于疾病的治疗，例如抗肿瘤。目前人类可以通过编译特定安全的细菌，靶向定位于瘤内并产生治疗分子或携带特定药物等技术达到抗肿瘤效应，联合传统化疗、放疗及特殊材料增强抗肿瘤效果。本综述通过归纳总结目前细菌疗法在抗肿瘤中的进展，希望能够给未来的癌症研究带来新的创意。
关键词：细菌疗法；细菌；抗肿瘤；靶向
本文引用格式：王敏,苏乌云.治疗癌症的新型武器—细菌[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(66):102-103,105.
Bacteria:A New Weapon Against Cancer
WANG Min1,SU Wu-yun2*
(1.Graduate School of Inner Mongolia Medical University,Hohhot Inner Mongolia;2.Department of Oncology,The Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot Inner Mongolia)
ABSTRACT:Bacteria can naturally grow inside of tumors.The technology is evolving so rapidly that today we can program these bacteria to treat disease like we program computers,such as the anti-tumor therapy.At present,we can compile specific safe bacteria to targeted positioning the tumor and produce molecules or carry specific drug to meet the anti-tumor effect,and combine traditional methods(chemotherapy,radiotherapy)and special materials to enhance anti-tumor effect.This review summarizes the current progress of bacteria in anti-tumor therapy,hoping to bring new ideas to cancer research.
KEY WORDS:Bacterial therapy;Bacteria;Anti-tumor;Targeting
0引言
化疗、放疗等传统的抗肿瘤方式，均存在耐药性、药物渗透的局限性、外周毒性等问题，促使需要新的替代性的癌症治疗[1-2]。而细菌是一种体积较小的微生物，并具有药物递送的优势，如减毒细菌菌株可逃避免疫攻击，但保留高选择性，靶向定植原发肿瘤和转移性病灶，且具有良好的安全性和肿瘤穿透性能[3-4]。因而，结合细菌所具有的药物递送的优势属性，开发了利用经基因工程编码的非致病性细菌靶向治疗肿瘤的概念—细菌疗法。近100年来，细菌和细菌产物被证明可用于治疗癌症[3]。目前，已经广泛建立了减毒细菌的安全性。因此，细菌载体正在成为抗肿瘤药物治疗的前沿[4]。科学家们还发现细菌与非生物材料的结合在治疗皮肤癌及恶性黑色素瘤中有巨大临床价值[5]。本文就细菌疗法在抗肿瘤治疗的研究进展展开综述。
1细菌抗肿瘤机制
1.1肿瘤特殊的乏氧微环境
（1）正常组织和肿瘤组织的细胞微环境和血管结构差异较大。与正常组织相比，肿瘤具有混乱的脉管系统和较大的毛细血管间距，阻碍了治疗分子的输送。（2）因肿瘤组织可自行生成血管造成血流异常，致使肿瘤细胞生长速率形成差异，部分缺乏血供的瘤细胞坏死，致瘤体内部出现乏氧区域。然而由此产生的乏氧区域，为厌氧菌提供了一个理想的生存环境[6]。（3）目前的化疗药物旨在以快速生长的癌细胞为目标，药物的瘤内渗透有限，对化疗药物无反应的一部分肿瘤静息细胞造成治疗遗漏，因而致使一部分未能被药物抑制的肿瘤细胞疯狂增殖，引发肿瘤的复发及转移[3]。即使治疗达到药理活性水平，一个罕见的先前存在的耐药性也经常存在并在治疗后扩大，其后果使以前被抑制的肿瘤细胞的迅速复活[3]。（4）同时肿瘤具有免疫逃逸特征，为细菌富集提供预防免疫清除的保护伞。
在动物实验中发现有多种厌氧细菌如梭菌属，沙门氏菌属，双歧杆菌属和埃希杆菌属能特定的在肿瘤组织中定植[7]。早在1997年，就报告了注射到肿瘤动物模型中的VNP20009（purI，msbB基因缺失的减毒沙门菌株）可优先定植于肿瘤。除了这种选择性在肿瘤组织中累积外，VNP20009还在许多肿瘤模型中具有抗肿瘤活性[8]。
1.2细菌的生物学特征
细菌可以利用趋化性、优势生长和能动的药物分子运输能力将抗肿瘤药物靶向的运载到肿瘤区域。（1）细菌基因容量大，遗传物质相对病毒等其他微生物更为稳定，利用此优势结合微生物技术，可持续靶向的运输药物到肿瘤微环境[9]。（2）抗生素的研究与应用目前较为成熟，使得细菌抗肿瘤疗法引起的不良反应更为可控。（3）利用细菌的细胞毒素和生物活分子可诱导癌细胞的死亡[10]。
沙门氏菌灵敏的化学感受器，可感知坏死肿瘤组织产生的特定分子，表现出明显的趋化作用。结合基因工程技术，改造的鼠伤寒沙门氏菌的亮氨酸/精氨酸突变体能特异的在小鼠前列腺肿瘤组织中积累[9]。经基因工程改造的营养缺陷体由静脉注入小鼠模型中后，会自动向含有高浓度营养素的肿瘤区域移动并优先增殖。除了内在运动之外，宿主的免疫防御系统可防止细菌在机体内扩散[6,9]。
细胞溶素A（ClyA也称为HlyE）是一种细菌毒素，可在哺乳动物细胞膜上形成孔并诱导细胞凋亡。用表达ClyA的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌治疗荷瘤小鼠模型可以减少肿瘤生长[11]。
2细菌疗法的研究进展
2.1细菌作为基因载体系统
将致病细菌经基因工程改造，可转变为安全性好、靶向性高、对宿主无毒、易被清除及可全身应用的治病工程菌。迄今为止，可作为基因载体的细菌属有沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌、梭菌和双歧杆菌等[7]。目前研发了多种具有抗肿瘤疗效的基因载体策略。
2.1.1外源性蛋白表达系统
细菌经过改造可作为外源性蛋白表达系统，表达不同细胞因子产生抗癌效果。研究使用短芽胞杆菌转化株表达重组小鼠肿瘤坏死因子-a（mTNF-a），该转化株可在注入小鼠体内几小时后持续提供mTNF-a。TNF-a敏感的肿瘤生长被抑制；对比直接瘤内注射重组mTNF-α，却被快速消除并未见肿瘤生长受抑制。血液生化和组织化学分析表明，静脉注射提供mTNF-a的转化株超过1周后，未导致明显组织损伤和功能障碍[12]。因此，该研究表明体内表达TNFα的细菌的治疗效果和安全性，突出了非病原菌作在抗肿瘤活性的平台的潜力。
2.1.2跨界基因传递
依据真核基因表达系统，有科学家提出将细菌的质粒转移到哺乳动物癌细胞中，这一过程被称为“bactofection”[9]。Kramer等将伤寒链球菌aro C突变体LVR01与表达白细胞介素12（IL-12）的alfaviral真核生物基因载体SFV-IL-12结合，转染局部进展期乳腺癌的小鼠模型，发现在任何单一治疗无效的情况下，该联合法可使高达90%的小鼠达到无病状态[13]。然而，这种跨界基因传递假设仍然存在争议，能否在体内中长期持续表达治疗性基因有待研究。
2.1.3富含CpG染色体外DNA
富含CpG（未甲基化的CpG二核苷酸）的特定细菌染色体外DNA已经被证明可以触发免疫细胞中（TLRs）的激活，引起抗癌效应[14]。广泛应用于浅表性膀胱癌的治疗的牛卡介苗的DNA早在1984年就被证明具有抗肿瘤特性[15]。卡介苗DNA中导致肿瘤消退的免疫刺激活，是由于其DNA片段中含有丰富的未甲基化CpG二核苷酸[14]。研究发现，基因改造的P.aeruginosa菌株8822不仅能分泌azurin（具有抗肿瘤效应的细菌蛋白），还能同时在生长介质中释放一种富含CpG片段的染色体外DNA，显示出抗肿瘤活性和TLR9的激活[14,16]。其他细菌能否释放CpG-富集的染色体外DNA，作为抗癌剂或调节免疫系统制剂靶向杀死癌细胞仍需进一步研究。
2.2细菌蛋白及其分泌蛋白可治癌
2.2.1Azurin和Laz的应用
细菌蛋白如Azurin和Laz最近被证明优先进入癌细胞并通过多种机制杀死癌细胞。铜绿假单胞菌与癌细胞接触释放Azurin，是一种28个氨基酸的片段，称为p28。Azurin具有优先进入癌细胞但仅少量进入正常细胞的特性，其在进入癌细胞后抑制蛋白p53的形成和稳定，诱导p53阳性癌细胞凋亡，还可干扰信号通路和血管生成来抑制各种癌细胞的生长[17]。Bernardes等研究发现Azurin与吉非替尼和厄洛替尼（针对表皮生长因子受体EGFR的酪氨酸激酶抑制剂）联合治疗可提高肺癌细胞对药物分子的敏感度而增强疗效[18]。奈瑟菌的Laz是类似于青霉素的蛋白质，比铜绿假单胞菌Azurin更有效地进入胶质母细胞瘤细胞引起癌细胞死亡[17]。
2.2.2细菌毒素
2.2.2.1免疫毒素
免疫毒素（immune toxic,IT）是一种针对肿瘤细胞特异性靶向而开发的嵌合蛋白。研究最广泛的俩种细菌毒素如白喉毒素和铜绿假单胞菌外毒素[19]。
白喉毒素是由白喉杆菌产生的一种单链毒素，毒性极强，称为白介素衍射毒素（Ontak），是美国食品和药物管理局（FDA）批准的，第一种用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的免疫毒素。通过改造与重组人白细胞介素-2（IL-2）结合，能靶向地与恶性T细胞上高表达IL-2受体结合诱导癌细胞死亡。但会产生严重的不良反应，因而白喉毒素研究被迫暂停[20]。
另一种单链毒素是铜绿假单胞菌外毒素（Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PE），有几种基于PE38(38Kda的PE片段)的免疫毒素还处于临床研究阶段。例如，由PE38与抗cd22单链抗体融合形成的免疫毒素BL22，第一种使嘌呤类似耐药毛细胞白血病（HCL）患者完全缓解的药物。BL22的突变体-HA22，可抵抗蛋白酶水解且高效杀灭多种肿瘤细胞系的B细胞[21]。
2.2.2.2孔隙形成毒素
孔隙毒素不同于单链毒素，其受体可以是糖、脂类或蛋白质，它们在细胞表面与受体结合后它插入细胞膜，允许电解质和其他小分子自由通过，造成渗透压不平衡引起细胞死亡。首先开发的成孔免疫毒素之一是从一种海葵中分离出来的特殊的溶细胞毒素与人转铁蛋白融合体，在体外可产生抗肿瘤效果，但具有非特异性的溶血活性等不足[19-20]。
2.2.2.3炭疽毒素
改造的炭疽毒素将单链毒素与成孔毒素优势结合，对黑色素瘤细胞具有特定的靶向性。美国国立卫生研究院与传染病研究所（NIAID）的Stephen Leppla及其他研究人员创造出了变异的炭疽热毒素，比天然毒素能更有效地杀灭黑色素瘤细胞，同时在血液中的浓度半衰期也较长。此外，进一步的研究还证实，改造炭疽热毒素的抗癌能力不只限于黑色素瘤，也能够抗击其他类型的癌症，比如结肠癌和肺癌[22]。
2.3细菌与非生物物质结合
2.3.1细菌与纳米材料的结合
一些特殊的细菌具有利用外源电子驱动细胞内反应的能力，鉴于此，给细菌大量的外源性电子-“给细菌充电”，可以控制细菌代谢活动来提高其潜在的抗癌潜力。氮化碳（c3n4）与携带一氧化氮生成酶的大肠杆菌（E.coli）联合用于光控细菌代谢产物治疗（PMT），PMT治疗可抑制约80%的肿瘤生长[23]。
研究表明，在黑暗环境中，c60纳米颗粒通过穿透细胞膜使细胞质发生泄露，从而表现出抗癌的特性；而在光照组中，c60与大气中的氧气发生反应，产生大量的导致癌细胞损伤的活性氧（reactive oxygen species,ROS）从而提高了抗癌效果。据报道，采用原脱水-再水合法制备了一系列新型细菌纤维素（BC）/c60（BCC 60）复合材料，证明了其在使用PDT（光敏治疗）治疗皮肤癌的多功能创面敷料中的潜力[24]。
2.3.2自噬抑制剂增强细菌疗法
孙逊教授和她的团队就提出了一种新的、简单有效的方法，利用细菌联合自噬抑制剂来治疗癌症。一种广泛使用的自噬抑制剂是羟氯喹（HCQ），可以通过提高酸性囊泡（如溶酶体）内的pH值防止囊泡内的细菌降解。孙教授研究团队将HCQ包埋在脂质体（HCQ-lip）中，观察到小鼠静脉给药24 h后肿瘤中HCQ蓄积增加了4倍。将VNP20009和HCQ-Lip荷瘤小鼠每隔一天静脉注射一剂，肿瘤组织中的VNP20009水平增加3.8倍，在侵袭性黑色素瘤小鼠模型中，肿瘤生长速度明显减慢，存活时间延长。该研究证明适度增加HCQ-Lip的积累，可提高VNP20009的疗效[5]。这种结合肿瘤靶向VNP20009和自噬抑制HCQ-Lip的创新策略简单易行，易于临床推广。
2.4细菌疗法联合传统疗法
细菌疗法联合化疗、放疗等传统疗法抗肿瘤效应增强，统称联合溶菌疗法（COBALT），为抗肿瘤治疗新增一有力武器[25]。
2016年陈赛英等将铜绿假单胞菌注射液（PA-MASH）联合TP化疗方案治疗复发性卵巢癌患者，发现实验组治疗后Karnofsky评分显著高于对照组，观察组的临床总有效率（82%）高于对照组（57%）；接受铜绿假单胞菌的复发卵巢癌患者的腹水在化疗后均明显消退直至消失，而对照组确有8例患者腹水未消失，且观察组肿瘤标志物CA125在化疗2~3个疗程后逐渐降至正常，由此细菌疗法联合化疗在卵巢癌的治疗中值得临床推广[26]。
乳杆菌活菌胶囊在HPV阳性晚期宫颈癌（IIb~IVa期）患者联合同步放化疗研究中，观察组HPV转阴率90.7%显著高于对照组55.8%，HPV持续阳性率9.3%显著低于对照组44.2%，实验结果说明乳杆菌活菌胶囊在宫颈癌同步放化疗中能够有效抑制HPV，有临床实用价值[26]。
3细菌疗法的前景与思考
在癌症治疗中，传统疗法的靶向性较差、不良反应多及易耐药等缺点目前仍是难以攻克的挑战，细菌的选择性定植使其成为一种递送抗癌基因或抑制性DNA片段等抗癌分子的载体，可改进目前的治疗方案存在的缺陷，当前研究的关键性问题是选择适当的菌种进行肿瘤的靶向治疗，其研究前景广阔。尽管细菌用于治疗癌症的研究有近百年发展史，部分细菌已运用于临床，但由于潜在的生物安全性和其他有害影响，如固有的细菌毒性、靶向效率降低、遗传不稳定性以及与其他治疗方法的存在的复杂的相互作用，使用细菌靶向肿瘤具有局限性。目前细菌治疗癌症的趋向性及体内毒性的机制仍知之甚少。尽管目前研究发现可以用抗生素终止大部分不良的减毒细菌感染，然而由于脓毒症休克和（或）肿瘤溶解综合征仍有发生可能，而且包括细菌毒素连同配方中的其他成分，均可引起发烧和感染[10]。此外，给药途径的不同也会影响抗肿瘤效应，寻找合理给药途径仍有待验证[10]。因此需进一步建立细菌疗法在抗肿瘤中的综合广泛图景为患者带来更多福音。
参考文献
[1]Wilhelm S,Tavares A J,Qin D,et al.Analysis of nanoparticle delivery to tumours[J].Nat Rev Materials,2016,1(5):16014.
[2]Gujrati V,Kim S,Kim SH,et al.Bioengineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Cell-Specific Drug-Delivery Vehicles for Cancer Therapy[J].Acs Nano,2014,8(2):1525-1537.
[3]Hoffman RM.Back to the Future:Are Tumor-Targeting Bacteria the Next-Generation Cancer Therapy?[J].Methods Mol Biol,2015,1317:239-260.
[4]Traore Mahama A,Sahari Ali,Behkam Bahareh,Construction of Bacteria-Based Cargo Carriers for Targeted Cancer Therapy[J].Methods Mol.Biol,2018,1831:25-35.
[5]Wang Y,Zhou Z,Chen W,et al.Potentiating bacterial cancer therapy using hydroxychloroquine liposomes[J].J Controlled Release,2018:39-50.
[6]Broadway KM,Suh S,Behkam B,et al.Optimizing the restored chemotactic behavior of anticancer agent Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009[J].J Biotech,2017,251:76-83.
[7]Gardlik R,Fruehauf JH.Bacterial vectors and delivery systems in cancer therapy[J].IDrugs:the investigational Drugs J,2010,13(10):701-706.
[8]Xu W,Zhou T,Zhou J et al.Attenuated Salmonella VNP20009 mutant(ΔhtrA) is a promising candidate for bacteria-mediated tumour therapy in hosts with TNFR1 deficiency[J].Lett.Appl.Microbiol,2018,67:97-103.
[9]Vassaux G,Nitcheu J,Jezzard S,et al.Bacterial gene therapy strategies[J].J Pathol,2010,208(2):290-298.
[10]Kramer M G,Masner M,Ferreira F A,et al.Bacterial Therapy of Cancer:Promises,Limitations,and Insights for Future Directions[J].Front Microb,2018,9:16.https://sci-hub.tw/10.3389/fmicb.2018.00016
[11]Dingfelder Fabian,Benke Stephan,Nettels Daniel et al.Mapping an Equilibrium Folding Intermediate of the Cytolytic Pore Toxin ClyA with Single-Molecule FRET[J].J Phys Chem B,2018,122:11251-11261.
[12]Murphy C,Rettedal E,Lehouritis P,et al.Intratumoural production of TNFαby bacteria mediates cancer therapy[J].PLoS One,2017,12(6):e0180034.https://sci-hub.tw/10.1371/journal.pone.0180034
[13]Kramer MG,Masner M,Casales E,et al.Neoadjuvant administration of SemLiki Forest virus expressing interleukin-12 combined with attenuated Salmonella eradicates breast cancer metastasis and achieves long-term survival in immunocompetent mice[J].Bmc Cancer,2015,15(1):1-15.
[14]Mahfouz M,Hashimoto W,Gupta T K D,et al.Bacterial proteins and CpG-rich extrachromosomal DNA in potential cancer therapy[J].Plasmid,2007,57(1):4-17.
[15]Morales A,Eidinger D,Bruce A W,Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the Treatment of Superficial Bladder Tumors[J].J.Urol.,2017,197:S142-S145.
[16]Yuan S,Qiao T,Li X,et al.Toll-like receptor 9 activation by CpG oligodeoxynucleotide 7909 enhances the radiosensitivity of A549 lung cancer cells via the p53 signaling pathway[J].Oncology Letters,2018,15(4):5271.
[17]Chakrabarty AM.Bacterial azurin in potential cancer therapy[J].Cell Cycle,2016,15(13):1665-1666.
[18]Bernardes Nuno,Abreu Sofia,Carvalho Filomena A et al.Modulation of membrane properties of lung cancer cells by azurin enhances the sensitivity to EGFR-targeted therapy and decreasedβ1 integrin-mediated adhesion[J]
.Cell Cycle,2016,15:1415-24.
[19]Zahaf NI,Schmidt G.Bacterial Toxins for Cancer Therapy[J].Toxins,2017,9(8):236-.https://sci-hub.tw/10.3390/toxins9080236
[20]Wang Zhaohui,Zheng Qian,Zhang Huiping et al.Ontak-like human IL-2 fusion toxin[J].J.Immunol.Methods,2017,448:51-58.
[21]Mazor R,Kaplan G,Park D,et al.Rational design of low immunogenic anti CD25 recombinant immunotoxin for T cell malignancies by elimination of T cell epitopes in PE38[J].Cellular Immunol,2017,313:59-66.
[22]Abrami L,Kunz B,Gisou vd GF.Anthrax toxin triggers the activation of src-like kinases to mediate its own uptake[J].Proceedings of the National Academy Sci,2010,107(4):1420-1424.
[23]Liu C,Gallagher JJ,Sakimoto KK,et al.Nanowire-Bacteria Hybrids for Unassisted Solar Carbon Dioxide Fixation to Value-Added Chemicals[J].Nano Letters,2015,15(5):3634-3639.
[24]褚明磊.细菌纤维素/富勒烯复合材料的性能研究及其在光动力疗法中的应用[D].华南理工大学,2017.
[25]陈赛英,苏成芳,朱启江.铜绿假单胞菌联合TP方案化疗对复发性卵巢癌患者免疫功能影响以及疗效观察[J].淮海医药,2016,34(1):7-9.
[26]张卜娟,刘学芬,陈晓品,等.乳杆菌活菌胶囊在宫颈癌同步放化疗中对HPV抑制作用的研究[J].检验医学与临床,2017,14(8):1071-1073.
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