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摘要：目的评价蛭龙活血通瘀胶囊对老年痴呆模型大鼠行为学能力的影响。方法腹腔注射D-半乳糖+双侧海马CA1区一次性注射聚集态Aβ1-40复合造模方法即可以制作出β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、老年斑（SP）、神经原纤维缠结（NFTs）三大阿尔茨海默病病理特征又符合以虚证为主夹有瘀血的老年痴呆大鼠模型，通过观察被毛光泽、爪甲红润光泽、眼光有神、表现灵活、反应迅速等外观形状，能量指标，血液流变指标，Morris水迷宫实验系统，学习记忆训练，观察蛭龙活血通瘀胶囊是否对AD动物模型有干预。结果蛭龙活血通瘀胶囊可改善该动物模型的认知学习行为学能力。结论蛭龙活血通瘀胶囊有效改善老年痴呆模型大鼠认知学习行为学能力。
关键词：气虚血瘀证；老年痴呆；蛭龙活血通瘀胶囊；证候模型
本文引用格式：罗钢，陈辉，杨思进.蛭龙活血通瘀胶囊对气虚血瘀型老年痴呆模型大鼠的干预研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(57):44-46.
Intervention of Zhilong Huoxue Tongyu Capsule on Senile Dementia Model Rats with Qi Deficiency and Blood Stasis
LUO Gang1，CHEN Hui2，YANG Si-jin1△
(1 Department of Cardioencephalopathy,Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Southwest Medical University，Luzhou,Sichuan；2.Department of Geriatrics,Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Southwest Medical University，Luzhou,Sichuan)
ABSTRACT:Objective To evaluate the effect of Zhilong Huoxue Tongyu Capsule on behavioral ability of rats with senile dementia.Methods Three major pathological features of Alzheimer’s disease,including deposition of beta-amyloid protein(Abet),senile plaque(SP)and neurofibrillary tangle(NFTs),were produced by intraperitoneal injection of D-galactose plus one-time injection of aggregated Abeta 1-40 into bilateral hippocampal CA1 region.The pathological characteristics of Alzheimer’s disease were in accordance with the senile dementia rat model with deficiency syndrome and blood stasis.The appearance shape,energy index,hemorheological index,Morris water maze experiment system,learning and memory training were used to observe whether Zhilong Huoxue Tongyu Capsule interfered with AD animal model.Results Zhilong Huoxue Tongyu Capsule could improve the cognitive learning behavior of the animal model.Conclusion Zhilong Huoxue Tongyu Capsule can effectively improve the cognitive learning and behavioral ability of Alzheimer’s model rats.
KEY WORDS:Qi deficiency and blood stasis syndrome;Alzheimer’s disease;Zhilong Huoxue Tongyu capsule;Syndrome model
引言
阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一种常见的痴呆类型，具有明显的神经变性。随着年龄的增长，AD的发病率逐渐增长，尤其是超过65岁的人群发病率更高，成为世界范围内影响人类健康的疾病之一[1]。该病的发病机制核心为淀粉样β-蛋白(amyloid-protein，Aβ)的聚集，特别是具有42个氨基酸长度的Aβ42，其形成的毒性细纤维具有不溶解性，经过聚集后形成具有神经毒性的β-褶薄片结构，构成神经突斑的中心核，是AD发病机制的重要物质基础[2-4]。目前西医药对于AD无明显确切疗效的药物[5]，杨凤云等[6]认为气虚血瘀是老年呆病的病理基础，益气活血是延缓衰老和防治老年痴呆的有效途径。包祖晓等[7]认为脾肾气虚是血管性痴呆的病理基础，瘀阻脑络是血管性痴呆的发病关键，而益气活血是治疗血管性痴呆的有效方法。中医药对于AD病有着悠久的历史及较好的疗效[8，9]，西南医科大学附属中医医院杨思进教授在30多年的临床实践中，认识到本病的基本病机是脑减髓消，痰瘀逆乱。治疗重点应抓脑与肾心的关系，兼顾肝脾。“蛭龙活血通瘀胶囊”是在此理论基础上形成的可治疗痴呆的院内制剂，临床应用多年，疗效较好，现以此方进一步研究其对老年痴呆早期模型大鼠的干预，观察其疗效及可能的机制，为后期该经验方的进一步推广应用做好准备。
1资料与方法
1.1动物与分组
2月龄的健康雌性SD大鼠60只，体重(200±40)g，由西南医科大学医学动物中心提供，均为一级合格动物。所有大鼠均为雌性，对其进行适应性饲养，时间为1周，将动物随机分为6组，空白对照组（n=10）、假手术组（n=10），AD模型组（n=10）、蛭龙:低剂量0.78g（n=10）、中剂量1.56g（n=10）、高剂量3.12g（n=10）[0.78g、1.56g、3.12g生药/kg/d（药物浓度分别为0.195、0.39、0.78生药/ml），给药体积4ml/kg]蛭龙活血通瘀胶囊：0.4g×36粒/瓶，由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批号：20120112。
1.2主要仪器
SJ-1组织脱水机，BMJ-1生物组织包理机，Leica切片机，ZDJ-1型展片机，400R低温离心机，普通光学显微镜，病理图像采集成像系统等。
1.3模型制备
所有大鼠在随机的原则下分为空白对照组、假手术组，AD模型组、蛭龙:低、中、高剂量组[0.78g、1.56g、3.12g生药/kg/d（药物浓度分别为0.195、0.39、0.78生药/ml），给药体积4ml/kg]，每组10只。根据目前AD模型制作方法[10]，我们创新性采用以腹腔注射D-半乳糖+双侧海马CA1区一次性注射聚集态Aβ1-40复合造模方法，期待制作出具有AD的三大病理特征的老年痴呆大鼠模型，包括β-淀粉样蛋白沉积、老年斑、神经原纤维缠结，同时与以虚证、夹有瘀血相符合。模型组和给药组大鼠采用腹腔注射的方法，均注射相同的用生理盐水配置的D-半乳糖60mg/kg/d，连续注射90d，空白对照组采用腹腔注射的方式将等量的生理盐水注入，并使用等量的双蒸水进行灌胃。用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成10μg/μl，并进行孵育，温度以37℃为宜，且经过1周的时间来制成凝聚态的Aβ1-40。当到第91d时则使用浓度为10%的水合氯醛对大鼠进行腹腔注射，做好麻醉处理，将其固定在江湾I-C型脑立体定位仪上，并使前后囟处于同一水平上，颅顶毛剪掉，并进行消毒处理，在正中做一切口，将前卤充分地暴露出来，参照GeorgePaxinos等1998年版《大鼠脑立体定位图谱》，将注射靶区选择好，以双侧海马CA1区为准，在前卤后的3.0mm，中线左侧、右侧旁2.2mm的位置，使用5ml的注射器针头在打磨圆钝后钻一个小孔，注意在钻孔的过程中不能穿透硬脑膜，再使用微量注射器从脑表面开始进针注射，深度以2.8mm为宜。AD模型组大鼠双侧海马CA1区分别微量注射Aβ1-401μl，注射时间为5min，控制好注射速度，留针一段时间，以保证溶液能够充分的弥散，再以较慢的速度撤针，完成注射后在局部使用复方新诺明药粉以免有感染的情况发生，将头皮进行缝合，并在术后进行青霉素的肌肉注射，每只4万U/d，共连续使用3d。正常对照组仅使用同量的生理盐水，其余的操作过程与前面组相同。假手术组海马注射相同剂量的无菌生理盐水。从第51d起，低、中、高剂量治疗组开始进行灌胃，使用药物为蛭龙活血通瘀胶囊，而模型组使用的是同等剂量的双蒸水，均连续使用40d。所有组别造模及用药完毕后开始观察指标。
1.4观察指标
1.4.1大鼠一般状况观察
动物喂养一般情况，包括外观状况、平均进食量、体重、游泳时间、精神状态评分等。
1.4.2舌象图像采集及分析
各组造模后，将照相机固定在体视显微镜架上，将体视显微镜光源调到最大。处于麻醉过程的大鼠被固定在镜架下，用无齿镊将舌尖位置夹住，采用轻拉的动作以与桌面平行的角度将其拉出，将相机置于手动模式进行拍摄，调整好光圈、焦距。将拍好的照片用PS软件进行处理后裁剪，大小为980×490，在水平方向和垂直方向分别设置10条参考线，随机选取6个x与y坐标交点记录该点红色、绿色、蓝色成分数值。
1.4.3Morris水迷宫实验系统
①定位航行试验:每天2次，跟踪记录大鼠游泳轨迹。将受试大鼠按顺时钟方向依次由E、S、W、N4个入水点顺序面向池壁放入水中，将大鼠在2min内找到平台的时间进行详细的记录，这个时间称为逃避潜伏期，这个时间越短则表明大鼠的学习记忆越强，时间越长则大鼠的学习记忆能力越差。若大鼠在2min以后仍未找到平台则将潜伏期记为120s。在训练的过程中可以帮助大鼠找到平台，并可停留一定的时间，大约为10s。②空间探索试验:以上试验完成后将平台撤去，使大鼠从任何的一个相同入水点下水，对大鼠的游泳轨迹和时间进行记录，在2min内大鼠会跨越虚拟平台，将频率和在平台象限内停留的时间进行测定。所记录的频率越高、在平台内停留的时间越长，则大鼠的学习记忆能力越强，相反则越差。将实验的时间固定下来，以上午的10点至下午的15点为实验时间。
1.5动物筛选标准
所有大鼠均在定位航行实验中训练5d，第5d正常组大鼠的平均逃避潜伏期作为参考值(A)，并将同一天模型大鼠的平均逃避潜伏期(B)计算出来，(B-A)/B>20%为痴呆大鼠。
1.6统计学处理
所有数据均使用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，组间差异采用单因素方差分析，两两对比采用LSD检验，取P<0.05作为显著性差异水平。
2结果
2.1大鼠一般情况观察
健康的大鼠毛有光泽，爪甲红润且有光，眼里有神，有灵活的表现，反应速度较快。模型组大鼠毛较为暗淡且枯燥，爪甲颜色较淡，眼睛处于微微睁开的状态且无神，行动起来较为迟缓，且反应速度慢；进食量逐渐下降，体重增长缓慢，体重均显著低于正常组，游泳时间出现了缩短，精神倦怠懒动等症状。皮肤和毛发的枯燥、无光泽为气虚血瘀证临床常见症状。模型组大鼠外观状况与气虚证机体失养、神疲症状相对应。
2.2大鼠舌象RGB值比较
对各组大鼠的舌质进行观察，通过图片进行详细的分析得出的结果见表1。模型组与对照组比较，蓝色成分与绿色成分差异均有统计学意义(P<0.01)。
2.3定位航行试验结果
模型组与药物干预组的逃避潜伏期与假手术组相比均有延长，差异有统计学意义(P<0.05)。同时模型组的延长程度更加明显，表明大鼠的学习记忆能力明显下降。各个药物干预组大鼠的逃避潜伏期与模型组相比较均有缩短，且不同的剂量间有统计学差异，其中高剂量与中剂量的缩短程度更明显(P<0.05)。而高剂量组相比中剂量的逃避潜伏期更缩短，但差异无统计学意义(P>0.05)。高、中剂量组与低剂量组比较，前两天EL缩短，差异无统计学意义，后3d缩短明显，差异有统计学意义(P<0.05)（见表2）。
2.4空间探索试验结果
模型组与各药物干预组大鼠的跨越平台频率与平台象限停留时间均少于或短于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；且药物干预组的停留时间更长，频率增加，高、中剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组的平台停留时间更长，跨越平台频率增加，但与中剂量间的差异无统计学意义(P>0.05)。两组与低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05）（见表3）。
3讨论
本研究中制作出β-淀粉样蛋白沉积、老年斑、神经原纤维缠结具有AD病理特征的老年痴呆大鼠模型，且符合以虚证为主夹有瘀血，采用的方法是腹腔注射D-半乳糖+双侧海马CA1区一次性注射聚集态Aβ1-40复合造模。经过试验发现，模型组大鼠的舌象颜色偏于青灰，与空白组进行比较，在红、绿、蓝三个颜色中的差异有统计学意义，有相关的研究显示，舌象与本身的症候有一定的联系[11]，表现为血淤的情况也和青舌、舌上有瘀斑和舌下经络青紫有很大的关系。
本实验通过Morris水迷宫实验发现，使用不同剂量的蛭龙均能不同程度地缩短AD模型大鼠的逃避潜伏期，延长平台象限停留时间，增加跨越虚拟平台的频率；能不同程度增加AD模型小鼠空间探索实验中原平台区停留时间和经过平台的次数，说明蛭龙活血通瘀胶囊具有改善AD模型小鼠水迷宫学习记忆能力，对AD模型小鼠具有明显的治疗作用。
蛭龙活血通瘀胶囊是由黄芪、桂枝、大血藤、地龙及水蛭等组成，其中黄芪补气、水蛭破血逐瘀、地龙通行经络，诸药合用，共奏益气活血、化瘀通络之功。前期已有大量的临床试验及动物实验研究证明其对痴呆有着较好的疗效[12-15]，本实验表明“蛭龙活血通瘀胶囊”能有效改善气虚血瘀证痴呆大鼠认知功能，为临床应用提供了较为科学、可靠的理论基础。
参考文献
[1]牟朝清,马进.阿尔茨海默病的病因病机研究进展[J].山西医药杂志,2019,48(04):435-438.
[2]H2.ARDY J A,HIGGINS G A.Alzheimer′s diseases:the amyloid cascade hypothesis[J].Science,1992,256(5054):184-185.
[3]SelkoeDJ.Alzheimer’sdisease:genes,protein,and therapy[J].PhysiolRev,2001，81(2):741-766.
[4]Nelson PT，Braak H，Markesbery WＲ．Neuropathology and cognitive impairment in Alzheimer disease:a complex but coherent relationship[J]．J Neuropath＆ExpNeurol，2009，68(1):1-14．
[5]郑易林,谢琼,肖立,等.抗阿尔茨海默病药物研发进展[J].药学进展,2019,43(02):100-110.
[6]杨凤云,杨凤云，丛英.老年呆病从气虚血瘀论治[J].吉林中医药，1999(01):1.
[7]包祖晓，胡灵敏，朱靖.柯干从气虚血瘀论治血管性痴呆的经验[J].中国医药学报，2004(08):492-493.
[8]张萌,巴哈尔·哈德尔.阿尔茨海默病中医研究进展[J].新疆中医药,2018,36(06):66-68.
[9]王琳琳,胡镜清,张治国,等.中药及复方减少阿尔茨海默病氧化损伤研究探析[J].世界科学技术-中医药现代化,2019,21(01):38-43.
[10]刘荣强,陈云慧,张天娥,等.阿尔茨海默病动物模型的研究进展[J].西部医学,2019,31(02):326-329.
[11]郑志新，马斌，高颖.最优尺度分析在缺血性中风病舌象提取中的应用初探[J].中华中医药杂志，2007(2):99-101.
[12]肖洪琴,白雪,杨思进.蛭龙活血通瘀胶囊的临床应用[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(08):81-82.
[13]李卫萍,尹思源,陈晓琴,等.蛭龙活血通瘀胶囊对血管性痴呆大鼠氧化应激损伤的保护[J].泸州医学院学报,2011,34(02):130-133.
[14]李卫萍.蛭龙活血通瘀胶囊对血管性痴呆大鼠的保护[D].泸州医学院,2011.
[15]陈晓琴.蛭龙活血通瘀胶囊对血管性痴呆大鼠的干预[D].泸州医学院,2010.
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