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摘要：目的研究附子理中汤对变应性鼻炎大鼠骨髓内皮祖细胞增殖的影响及意义。方法复制变应性鼻炎的疾病模型，将48例模型大鼠分为空白组和治疗组（附子理中汤灌胃治疗），雌雄各半，每组24例。在模型建立后的0、1、3、7天分别评价两组的症状积分及取材检测骨髓内皮祖细胞的含量。结果空白组的症状积分始终无明显差异性（P>0.05），而骨髓内皮祖细胞却持续减少（P<0.05）；治疗组的症状积分持续减少，且在第3天、第7天时与第0天比较的差异性均有统计学意义（P<0.05），但骨髓内皮祖细胞未见明显减少（P>0.05）。两组间比较，第3天、第7天的同期症状积分比较均有差异性（P<0.05），而骨髓内皮祖细胞差异性在第7天显现出来（P<0.05）。说明治疗组能有效、持续地改善变应性鼻炎大鼠的症状，且能有效维持体内骨髓内皮祖细胞的含量。结论附子理中汤能在有效缓解变应性鼻炎的症状的同时维持体内骨髓内皮祖细胞的表达。
关键词：变应性鼻炎；附子理中汤；骨髓内皮祖细胞；增殖
本文引用格式：柴宇琪,忻耀杰,滕磊.附子理中汤对变应性鼻炎大鼠骨髓内皮祖细胞增殖的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(80):31-32,34.
Effect of Fuzi Lizhong Decoction on Proliferation of Bone Endothelial Progenitor Cells with Allergic Rhinitis
CHAI Yu-qi,XIN Yao-jie*,TENG Lei
(Dept.of Otolaryngology,Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai)
ABSTRACT:Objective To investigate the effect and significance of Fuzi Lizhong decoction(FZLZD)on proliferation of Bone Endothelial Progenitor Cells(BEPCs)in rats with allergic rhinitis.Methods The disease model of allergic rhinitis was replicated.48 model rats were divided into blank group and treatment group(treated with FZLZD),male and female,with 24 cases in each group.The symptom scores of the two groups were evaluated on the 0,1,3,and 7 days after the model was established,and the content of BEPCs was determined.Results There was no significant difference in symptom scores in blank group(P>0.05),while BEPCs continued to decrease(P<0.05).The symptom scores of the treatment group continued to decrease,and the differences between the 3rd day and the 7th day compared with the 0th day were statistically significant(P<0.05),but BEPCs did not decrease significantly(P>0.05).Compared between the two groups,there were differences in symptom scores on day 3 and day 7(P<0.05),while difference in the content of BEPCs appeared on the 7th day(P<0.05).It is indicated that the treatment group could effectively and continuously improve the symptoms of allergic rhinitis rats，and effectively maintain the content of BEPCs in vivo.Conclusion FZLZD can effectively relieve the symptoms of allergic rhinitis while maintaining the expression of bone marrow endothelial progenitor cells in vivo.
KEY WORDS:Allergic rhinitis;Fuzi Lizhong decoction;Bone endothelial progenitor Cells;Proliferation
0引言
毛细血管扩张、血管通透性增加是已经被证实的变应性鼻炎的病理变化基础之一，在此过程中血管内皮细胞（EC）发挥重要的作用，初始血管内血细胞与内皮下基质成分隔离屏障作用外，还参与了机体的炎症反应和免疫应答过程。而骨髓内皮祖细胞（BEPCs）能定向增殖分化为EC。本实验构建变应性鼻炎的大鼠模型，并给予附子理中汤治疗,通过对治疗组前后对比以及与空白组进行比较探究变应性鼻炎大鼠BEPCs增殖的变化。
1资料与方法
1.1实验动物
6周龄清洁级SD大鼠36只，雌雄各半，体重均位于160-230g之间，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。自由进水、常规饲料喂养，室温稳定于20℃-25℃,空气湿度为60%。
1.2实验试剂和设备
卵清蛋白（Ⅴ级Sigma，美国）；氢氧化铝、PBS磷酸盐缓冲液、抗体稀释液(科夷生物科技有限公司提供)；CD34（ab81289）单克隆抗体、CD133（ab19898）单克隆抗体和VEGFR2（ab9530）单克隆抗体（Abcam，美国）；FITC-Goat Anti-Rabbit（SA00003-2）和PE-Donkey Anti-Mouse（SA00008-9）（Proteintech，美国）；Fresco离心机（Thermo，美国）；FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国）；Scepter细胞计数器（Millipore，美国）。
1.3实验分组
将48只SD大鼠按雌雄分别随机分成2组，每组雌雄各半，各组24只。空白组为变应性鼻炎模型组；治疗组为变应性鼻炎模型+附子理中汤方组。治疗组于模型建立次日开始连续7天用按成人剂量折算用药量的附子理中汤2mL灌胃；空白组不做任何处理。
1.4模型复制
①系统致敏阶段：以20mg卵清蛋白加入30mg氢氧化铝为免疫佐剂，溶于1mL 0.9%氯化钠注射液中，腹腔注射，隔日1次，共8次；②鼻腔激发阶段：在完成系统致敏后，每日以50mg卵清蛋白溶于1mL 0.9%氯化钠注射液中，制成浓度为5%的溶液，滴鼻激发变态反应，每只大鼠每侧鼻腔50µL滴鼻，连续10日；③局部维持阶段：每次治疗前鼻腔继续用卵清蛋白激发，以维持变应性鼻炎的发作状态。
1.5检测方法
变应性鼻炎模型建立当天为0天，当天两组即取材一次，在1、3、7天，治疗组灌胃治疗后2小时，给两组取材，每次每组6只大鼠，雌雄各半。大鼠拉颈处死后，取完整右侧股骨，洗涤后冲洗骨髓腔，经洗涤离心稀释后，调节细胞浓度后收集100uL做检测，分别加入CD34、VEGFR2一抗震荡，PBS洗涤重悬后加入FITC-Goat Anti-Rabbit和PE-Donkey Anti-Mouse二抗孵育，再洗涤重悬后加入CD133一抗振荡，加入APC-Goat Anti-Rabbit二抗孵育，最后PBS洗涤后上流式细胞仪检测。将检测到的表面标志物CD34/CD133/VEGFR2阳性的细胞定为BEPCs。
1.6统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件，计量资料采用t检验，检验水准为P=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1鼻部症状评分
比较0、1、3、7天取材的大鼠的鼻部症状，包括喷嚏、抓鼻、喘息、鼻分泌物4项，轻重程度分别为0-1-2-3分。空白组和治疗组在各时间节点的鼻部症状评分见表1。结果显示，空白组在0、1、3、7天的积分比较无明显差异性（P>0.05）。而治疗组在第1天治疗后积分即已减少，此时和0天比较尚无差异性，此后积分逐日减少，在第3天时积分与第0天比较即显示出差异性（P<0.05），第7天时差异性更加明显。两组间同期比较，第0、1天时积分比较无明显差异性（P>0.05）。第3天、第7天的积分比较均有差异性（P<0.05）。说明治疗组能有效、持续地改善变应性鼻炎大鼠的症状。
2.2BEPCs检测结果
比较0、1、3、7天取材的大鼠的BEPCs，将检测到的表面标志物CD34/CD133/VEGFR2阳性的细胞占比取对数（lg）比较。空白组和治疗组在各时间节点的BEPCs对数值见表2。结果显示，空白组的BEPCs随着时间的推移逐渐减少，而且在第1天时即与0天的比较有差异性（P<0.05）。治疗组的BEPCs在第1天时有减少，但与0天比较无明显差异性（P>0.05），第3天时与第1天时基本持平，第7天时含量又有升高，且与第0天比较有差异性（P<0.05）。两组间比较，第7天时的BEPCs比较有差异性（P<0.05）。说明在变应性鼻炎发生后，大鼠自身的BEPCs增殖不明显，而治疗组对BEPCs增殖的影响也不明显，直至第7天时BEPCs的增殖才略有升高，不过也仅维持在第0天的含量水平（P>0.05），但相对于空白组来说，治疗组对BEPCs增殖是有趋化作用的。
3讨论
变应性鼻炎的根本原因是脏腑虚损，正气不足，与肺、脾、肾三脏的功能关系最为密切。病位虽在肺，但病源在脾，病根在肾[1]。如玉屏风散治疗变应性鼻炎的广泛应用，不仅可改善症状，还可以增强机体免疫功能，调节免疫失衡[2]。但治疗上总是以益气温阳为主[3]。因此，具有温阳祛寒，益气健脾的附子理中汤临床常用于变应性鼻炎的治疗。从大鼠的实际症状表现来看，本实验也表明了附子理中汤确实可以有效持续地缓解变应性鼻炎大鼠的局部症状。
变应性鼻炎局部表现的基础，有一种观点是变应性疾病中释放的物质包括如乙酰胆碱、神经肽、炎性活性介质等都会引起微循环的改变。如早就有研究在排除冠心病、高血压、紫癜、血小板减少等其他相关性疾病的基础上，对56例变应性鼻炎、哮喘病例进行毛细血管脆性检测，结果发现患者毛细血管脆性增加[4]。而微循环改变的原因，随着变应性鼻炎基础研究的逐渐深入而越来越清晰。在这个过程中EC起到了重要的作用。变态反应是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞等能向局部浸润的细胞群由EC、上皮细胞、成纤维细胞等组织构成细胞间复杂的相互作用形成的。
变应性鼻炎现在表述为：异感个体接触致敏变应原后导致的包含IgE介导的炎症介质的释放和多种免疫活性细胞、细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症性疾病[5-7]。这一表述更加明确阐述了炎症介质、黏附因子、细胞因子在变应性鼻炎发病过程中的作用，由于众多炎症介质及黏附分子的参与和相互作用，使变应性鼻炎的发病呈现一种复杂多变的特性和趋势。如血管细胞粘附因子-1（vasular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）就是EC表达的粘附分子之一，有实验研究VCAM-1和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）的关系，Eotaxin主要来源于上皮细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。到目前为止，已确定的趋化因子有20余种，只有Eotaxin对嗜酸性粒细胞具有特异性及强大的趋化作用[8]；另外,Eotaxin引起嗜酸性粒细胞向气道组织的迁移、活化，脱颗粒释放活性物质，导致气道的损伤，是引起气道高反应性、间歇性气道阻塞和气管炎等哮喘的病理生理改变[9,10]。VCAM-1是一种重要的细胞黏附因子，实验通过免疫组化方法观察了Eotaxin、VCAM-1在大鼠模型鼻黏膜中的表达，证明VCAM-1、Eotaxin的表达强度呈正相关[11]。说明EC在变应性鼻炎中起到的作用不可忽视，而实际上EC确实参与了机体的炎症反应和免疫应答过程。EC通过表达多种免疫相关分子参与或影响免疫过程。能以MHC-Ⅱ类分子限制性方式提呈抗原,同时可通过B7/CD28、CD40/CD40L、CD58/CD2等途径向T细胞提供活化所必需的共刺激信号。TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子在变应性鼻炎模型中高度表达，而在治疗后含量又显著降低[12]。而细胞因子TNF-α、IL-6由EC生成。EC表达的粘附分子介导EC与不同白细胞亚群间相互作用,对白细胞粘附穿过EC进入组织间隙参与炎症反应、淋巴细胞归巢或再循环等过程有重要意义。EC可表达补体调节因子调节补体系统活化。EC受多种因素激活后所表达的免疫相关分子表达上调,如核因子-kappa B(NF-κB),其信号通路为广谱信号通路，被认为是炎症反应的中心环节，是具有基因转录调节功能的核转录因子蛋白质家族。现已证实其与变应性鼻炎的发生、发展密切相关[13]，在此基础上产生多种细胞因子,参与机体的炎症反应及免疫应答,是重要的免疫调节细胞[14]。其自分泌的血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子可直接接触细胞，介导免疫调节活性，或通过抗原递呈细胞参与介导免疫调节，或直接诱导T细胞凋亡，还可通过信号通路介导形成综合网络调控作用。其中主要的作用途径是通过显著抑制淋巴细胞增殖，升高调节性T细胞(Treg)比例而发挥作用[15]。正常人群中Treg能够有效地抑制Th2反应，而过敏人群常伴有Treg功能受损会导致Th2的异常激活，出现免疫失衡。
基于附子理中汤可以改善免疫功能以及EC参与的免疫应答功能，也就EC的前体就非常有必要。BEPCs是骨髓干细胞的一种，是EC的前体，亦称成血管细胞。该细胞最早于1997年被Asahara等证明存在于循环外周血中并能分化为血管内皮细胞，在缺血刺激下可通过动员到外周血，迁移、归巢到血管新生部位，并在迁移部位增殖、分化为内皮细胞，在体内具有明显的内皮修复及促血管新生作用[16]。故血管壁的内皮功能紊乱和损伤亦可由骨髓源性的EPCs修复[17]。多数研究认为EPCs是表达CD34、CD133、VEGFR-2的细胞。基于以上认识，本次实验采用流式细胞检测技术，观察附子理中汤对变应性鼻炎大鼠BEPCs增殖的影响，可以发现，空白组的BEPCs随着时间的推移逐渐减少，而且在第1天时即与0天的比较有差异性（P<0.05）。治疗组的BEPCs在第1天时有减少，但与0天比较无明显差异性（P>0.05），第3天时与第1天时基本持平，第7天时含量又有升高，且与第0天比较有差异性（P<0.05）。两组间比较，第7天时的BEPCs比较有差异性（P<0.05）。说明在变应性鼻炎发生后，相对于其他的骨髓干细胞来说[18]，大鼠自身的BEPCs增殖并不明显，空白组甚至在持续减少，可能是大鼠自身对BEPCs消耗所致，而附子理中汤对BEPCs增殖的影响虽不明显，但相对于空白组来说，保持在一个高位，说明附子理中汤对BEPCs增殖是有趋化作用的。但附子理中汤对BEPCs的增殖是如何介导变应性鼻炎鼻腔黏膜组织的屏障修复和功能恢复的，无疑还需要中间环节的基础研究。
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