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摘要：动物细胞工程是一门内容广泛，应用性和实践性强的科目。为了提高细胞工程的实验教学质量，有效将理论知识过渡到实践中去，文章对大班实验条件下的实验课程中动物组织原代培养的方法进行了优化，以期解决实验教学现状的问题，提高学生的综合分析和学习能力。
关键词：细胞工程；原代培养；实验教学；动物组织；优化
本文引用格式：黄丽贞，等.大班实验条件下动物组织原代培养方法的优化[J].教育现代化,2019,6(45):241-243,258.
动物细胞工程是现代生物工程中涉及范围广、应用性强的一门技术，其渗入到制药、医疗等各个领域，如单克隆抗体的制备、试管婴儿、干细胞移植治疗等[1]，也是生命科学课程设计的重要组成部分之一。作为一门理论和实践同样重要的学科，动物细胞工程有着以实践为核心，理论为指导的典型特点。至今，动物细胞工程已经有成熟的理论体系，同学们可通过老师的讲解和查阅相关书籍资料加深对理论知识的吸收，而仅仅有充分的理论知识而缺少实践锻炼是不够的。实验教学是把理论带入实际，从书本过渡到实践的重要途径，它不仅能让学生在实验中巩固自己所学的知识，提高动手能力和综合分析能力，还对学生未来从事细胞工程相关研究打下基础具有重要意义。然而，许多高等院校的实验教学中，仍存在各种障碍有待处理和完善，如在20~30人合班上课的情况下，实验的开展更有难度。为此，为了提高动物细胞工程实验教学的效果，笔者根据前人的实践经验，对乳鼠原代细胞培养的实验设计和方法进行了总结和改进。
一动物细胞培养实验教学现状
实验教学是动物细胞工程学科必不可少的环节，但许多院校在开展实施中，想要充分利用实验课程传授知识时，仍面临各种不同的挑战，表现在以下几个方面：1.动物细胞工程内容丰富，应用性强，但由于教学课时有限，不能一一开展，想要有限的时间内尽可能让学生参与到实践，又要保证教学质量，就要合理精选实验课程的内容；.2教学资源有限，许多院校仍难以配备先进的实验设备，而教学经费限制了多种实验教学的实施；3.在科研人员广泛的研究下，动物细胞原代培养技术在文献和书籍都可以轻易查询，但培养方法的效果参次不齐，为有效达到教学目的，需总结出稳定可靠的实验方案。
二实验方法的设计和改良
（一）培养细胞类型的选取
根据体外培养的细胞是否贴壁可分为贴壁型和悬浮型细胞，而贴壁型细胞又可以分为上皮细胞型、成纤维型、游走细胞型和多形型细胞四类，因此，为了让学生更深刻了解到各种类型细胞的离体生长状态，实验以哺乳动物体内的器官为基础进行设计。根据以前的实验反馈，肝细胞的原代培养成功率很低，可能对其严格的生长环境和特殊的提取方法有关，因此不选用作教学实验，而选取了心肌细胞、肺成纤维细胞、脾淋巴细胞、肾细胞、神经元为实验对象。另外，考虑到动物细胞工程发展迅速，而其中的干细胞研究仍是目前最具活力和应用前景的科研领域之一，为做到与时俱进，还选取了骨髓间充质干细胞作为实验对象。
（二）实验材料
实验动物：大鼠乳鼠（1~3天）
基础试剂：H-DMEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、EDTA、D-Hanks液等
特殊试剂：Ⅱ型胶原酶、红细胞裂解液
实验仪器：电子天平、恒温水浴锅、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、低速离心机、磁力搅拌器和超净工作台。
（三）各种原代细胞培养方法
1.心肌细胞
取新生乳鼠于75％酒精中浸泡3秒后迅速取出，重复3次，移入超净工作台固定，剪头处死。无菌眼科剪剪开胸腔后，用无菌镊子夹住心尖部位，分离心脏于预冷的D-Hanks液。将鼠心脏全部取出后，剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管（仅留心室组织），用D-Hanks液在培养皿中反复漂洗3次左右，去除血污，转移至三角瓶中，并用眼科剪将心脏组织均匀剪成约1mm3的碎块。加入1.5mL 0.125％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合液（1:1混合）轻轻吹打，在37℃恒温水浴锅中消化6min，不断震摇，待自然沉降后弃上清液，再加入约1.5ml 0.08%胰蛋白酶与0.05%Ⅱ型胶原酶的混合酶，在37℃恒温水浴锅中消化5min，其间震摇3min，吸取上清液转移至另一预冷三角瓶，加入等体积含10％小牛血清的H-DMEM培养液终止消化，重复以上步骤，消化5~8次（根据组织的形态决定消化次数）。最终得到的消化液经200目筛网过滤至15mL离心管中，1000r/min离心8min，弃上清，用含10％小牛血清的H-DMEM培养液重悬细胞，调整好细胞密度后接种于35mm塑料培养皿中，于48h后再进行第一次换液，之后隔2~3天更换一次。
心肌细胞是终末分化细胞，几乎不能进行增殖，因此如何掌控分离的强度和时间，消化出完整的心肌细胞是实验成功的关键。有研究发现[2]{张乃菊,2010#32;张晓京,2012#33}，因胰蛋白酶消化作用强，不易控制，容易对心肌细胞产生损伤，而使用低浓度胰蛋白酶与作用缓和的胶原酶混合并反复多次消化，起到有效作用。消化时间要结合实际，当组织块变为半透明胶原状即终止消化。心肌细胞代谢旺盛，离体情况容易缺氧，因此在分离过程中要注意使用冰袋保持在低温状态，而分离时间不宜过长。心肌细胞原代培养最主要的杂细胞为心肌成纤维细胞，若想获得纯度较高的心肌细胞可用差速贴壁法[3]纯化，而实际操作中，同学们第一次实验分离出的心肌细胞数量较少，因此笔者建议直接进行培养。心肌细胞典型特点为其具有自发性搏动，学生可对其搏动频率进行观察和拍视频记录。
2.肺成纤维细胞
新生乳鼠用75％酒精浸泡消毒后，于超净工作台中剪头处死，固定。无菌打开胸腔，取出肺脏置于装有D-Hanks液的无菌培养皿中，去除胸膜及肺周围结缔组织，并用D-Hanks液反复漂洗至肺组织变白，液体澄清。用无菌眼科剪将肺脏剪切成1mm3的组织块。
组织块法：将剪切好的组织块按0.5~1cm的距离均匀放置在25cm2塑料培养瓶底面，并于37℃，5%CO2，湿度95%的细胞培养箱内倒置贴壁2h。组织块贴于瓶底后，将培养瓶翻正，沿瓶壁轻轻滴加含10％小牛血清的H-DMEM培养液至浸没组织块。继续静置培养，待细胞爬出组织块并形成细胞岛后，除去组织块。以后每隔2~3天换液一次。
酶消化法：将剪好的组织块放入无菌的15ml离心管中，往离心管内加入适量0.1％胰蛋白酶，没过组织块，于37℃消化约15min。待大部分组织块被消化，形成细胞悬液后，加入等量的培养液终止消化，轻轻吹打混匀，经200目细胞筛网过滤后，将细胞悬液移至另一15ml离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清，调整细胞浓度后用含10％小牛血清的H-DMEM培养液于25ml塑料培养瓶中培养，以后每隔2~3天换液一次。
原代培养时，肺成纤维细胞主要呈梭型或不规则三角形，并有少量上皮样细胞混杂其中。肺成纤维细胞原代培养主要采用组织块法和酶消化法[4]。实验中发现，对比组织块法，酶消化法操作相对复杂，培养效果较不稳定。组织块法不受酶的化学影响，最大限度保留肺成纤维细胞的原始形态，而杂质细胞相对较多，培养效果受到组织块大小和分布位置的影响；酶消化法中，由于胰蛋白酶的作用强度难以控制，容易受到温度、时间、浓度的影响，从而影响细胞的存活和贴壁，因此掌控好组织消化程度是酶消化法的关键，而多次离心也容易造成细胞的丢失和损伤。
3.脾淋巴细胞
乳鼠消毒并剪头处死后，打开腹腔，无菌取出脾脏于灭菌培养皿中，除去脾脏表面的脂肪和结缔组织并用D-Hanks液清洗1~2次。将脾脏剪成小块后置于100mm无菌培养皿内的200目不锈钢筛网上，加入适量D-Hanks液并用无菌注射器内芯轻轻研磨，研磨结束后再用适量D-Hanks液冲洗筛网，获取细胞悬液。将细胞悬液移入15mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入3-5mL氯化铵红细胞裂解液，吹打均匀。裂解5min，1000r/min离心5min弃上清。加入5ml D-Hanks液洗涤，1000r/min离心5min，重复冲洗2次。弃上清后，加入3mL含10％小牛血清的H-DMEM培养液，重悬细胞。将细胞密度调整到5×105/mL左右转移至25 mL细胞培养瓶中，5%CO2，37℃下培养。
脾淋巴细胞为悬浮型细胞，镜下观察呈圆形，折光性强，其分离培养过程中主要的杂细胞为红细胞，故加入红细胞裂解液可有效除去悬液中的红细胞。在实验室配制红细胞裂解液时，注意浓度要准确，做好过滤除菌，每次使用要新鲜配制，也可购买商品化的红细胞裂解液保证裂解效果。
4.肾细胞
新生乳鼠消毒后，于超净工作台中剪头处死，固定。无菌打开胸腔，将肠管移到一侧以暴露腹腔背壁肌注两侧的肾脏。取出肾脏置于装有D-Hanks液的无菌培养皿中，去除被膜与肾门结缔组织，并用D-Hanks液充分漂洗除去血污。用无菌眼科剪将肾脏剪切成1mm3的组织块，再用D-Hanks液洗2~3次，吸弃上清。
组织块法：将剪切好的组织块按0.5~1cm的距离均匀放置在25mL塑料培养瓶底面，翻转瓶底朝上，将含10％小牛血清的H-DMEM培养液加至瓶中，注意培养液不要接触组织块，并于37℃，5%CO2，湿度95%的细胞培养箱内倒置贴壁2h。组织块贴于瓶底后，将培养瓶轻轻翻正，使组织浸入培养液中，继续静置培养。待细胞爬出组织块并形成细胞岛后，除去组织块。以后每隔2~3天换液一次。
酶消化法：将剪好的组织块放入无菌的15ml离心管中，往离心管内加入适量0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合液（1:1混合），没过组织块，于37℃水浴中消化约20min，期间每隔5min摇晃1次。待大部分组织块被消化变白后，加入等量的含血清培养液终止消化，轻轻吹打混匀，经200目细胞筛网过滤后，将细胞悬液移至另一15ml离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清，加入含10％小牛血清的H-DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度后于25ml塑料培养瓶中培养，24h后进行第一次换液，以后每隔2~3天换液一次。
肾细胞主要为上皮细胞型，镜下观察呈扁平不规则多角型，细胞紧密相连，成铺路石状。肾细胞常用分离培养方法有组织块法、胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法[5]，由于胶原酶价格昂贵，考虑到经费问题，故不采用。组织块法步骤简单而培养时间较长；胰酶消化法受到时间温度影响，消化过度或消化不足皆影响细胞的培养效果。EDTA能从组织中与Ca2+、Mg2+形成螯合物促进细胞分离，实验中与胰蛋白酶合用对分离肾细胞有良好效果。
5.骨髓间充质干细胞
新生乳鼠用75％酒精浸泡消毒后，于超净工作台中剪头处死。无菌条件下分离后肢双侧胫骨及股骨，剔除周边的肌肉、肌腱及结缔组织，用无菌眼科剪剪去两端的骨骺端，充分暴露骨髓腔。用5mL注射器吸取H-DMEM培养基，反复冲洗骨髓腔至变白，并收集骨髓悬液置于15ml离心管，1000r/min低速离心5min，弃上清。用3mL新鲜含10％小牛血清的H-DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度以1×106个/mL接种在60mm塑料培养皿中，并置于培养箱中进行培养。倒置显微镜下观察细胞贴壁状态，48h后进行首次换液，以后每隔3天换液1次。
原代骨髓间充质干细胞呈长梭型成纤维细胞样，其常用的分离方法有全骨髓贴壁法和密度梯离心法。分离骨髓间充质干细胞时会有许多造血系细胞的混杂，而全骨髓贴壁法可根据骨髓间充质干细胞贴壁生长、造血系细胞悬浮生长的特性进行分离。对比起密度梯度法，全骨髓贴壁法分离的细胞增殖较快[6]，并有着步骤简单、减少污染并节约经费的优点。
6.大脑皮层神经元
新生乳鼠用75％酒精浸泡消毒后，于超净工作台中剪头处死。将乳鼠头部放入置于冰袋上的无菌培养皿中，用预冷的D-Hanks液冲洗去除血污，然后剪开头骨，暴露两大脑半球，用灭菌眼科镊将脑组织夹起于另一个无菌培养皿中（置冰袋上），去除小脑、延髓，剥离脑膜和血管，分离大脑皮层并将其剪碎成0.5~1mm³的小块，用预冷D-Hanks液清洗两次。
把组织碎块移入15mL离心管中，加入5倍体积0.125%胰蛋白酶消化液，置于37℃水浴锅中消化15~20min，其间轻轻震荡几次。待组织块变得疏松有透明感时，加入等量含血清培养液终止消化，经200目细胞筛网过滤，并以1000r/min离心5min，弃去上清。加入含10％小牛血清的H-DMEM培养液重悬细胞，以1×106个/mL的密度接种于塑料培养皿中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液，以后每隔3天进行半量换液。
神经元为终末分化细胞，在体外不能增殖。神经元培养过程中，常与非神经元细胞如神经胶质细胞、成纤维细胞混合培养，但其折光性较强，胞体饱满，有突起伸出且相邻神经元有互相连接形成神经网络，故容易区分。实验中选择的动物为新生乳鼠，栗建新[7]认为，新生24h内的乳鼠更适合神经元的分离培养。分离皮层组织时，为降低脑组织的代谢，保持神经元活性，应在低温下进行，且分离时间不宜过长。消化组织碎块时要控制好酶的作用时间，机械吹打细胞悬液时要轻柔，尽力减少对神经元的物理损伤。
三结语
全文共总结了6种哺乳动物细胞的原代培养方法。从材料方面，实验动物均为新生大鼠乳鼠，比起成年鼠，新生乳鼠体内大多组织器官仍未发育成熟，处于旺盛的分裂生长时期，且所含的胶原组织较少，对于难以消化组织如心肌细胞也能有较好的分离效果。在实验中，根据不同种类的细胞可将大班分为几个小组，各组之间可从各自实验动物中互相交换所需的器官组织，既保证了材料的充足，也节省了实验动物的费用。另外，我们选用的试剂除各种细胞分离时所需的特殊试剂外，其余都相对统一，各组同学可以分工准备一起所需的试剂材料，节省各自准备所花的额外经费，也有利于大班实验课程的开展。从实验效果方面，本文设计和总结的方法步骤简单，减少了复杂的细胞提纯方法，但细胞状态活力比较稳定，也可很好地达到教学的目的，难度适合第一次实验的学生。
参考文献
[1]邱忠毅.细胞工程技术的应用[J].生物化工，2018，4(04):140-143.
[2]刘博，刘小雷，潘桂兰，等.乳鼠心肌细胞的原代培养方法改良[J].中南药学，2017，15(01):18-21.
[3]蒋学友，张丽，俞晨，等.SD乳鼠心肌细胞原代培养及纯化方法的优化探索[J].四川大学学报(医学版)，2015，46(02):301-304.
[4]孙月，徐洪，徐丁洁，等.新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立[J].医学研究生学报，2014，27(02):129-132.
[5]张丽娇，田园僮，丁亦男，等.小鼠肾细胞分离培养方法的改良[J].黑龙江畜牧兽医,2013(7):145-146.
[6]Zhang W,Zhang F,Shi H,et al.Comparisons of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Isolation and Culture Methods In Vitro[J].PLoS One.2014;9(2):e88794
[7]栗建新.大鼠原代神经元的培养及操作技巧[J].北方药学，2017，14(08):137+170.
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