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【摘要】目的 探讨吻素 -1(Kiss-1)、周期蛋白 E(Cyclin E)在结直肠癌组织中的表达情况，分析其阳性表达与患者临床病理特 征的关系，以期为临床治疗该疾病提供参考依据。方法 回顾性分析常熟市第一人民医院 2016 年 1 月至 2020 年 3 月接受手术治疗的 85 例结直肠癌患者的临床资料，并搜集其术后结直肠癌组织与癌旁组织石蜡标本，分别作为结直肠癌组、癌旁组;采用免疫组织化学染色 法检测两组 Kiss-1 、Cyclin E 蛋白表达情况;分析 Kiss-1 、Cyclin E 蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果 结直肠癌组中 Kiss-1 阳性表达患者占比显著低于癌旁组， Cyclin E 阳性表达患者占比显著高于癌旁组(均 P<0.05 ); Kiss-l 蛋白阳性表达中低分化、有 淋巴结转移、Ⅲ + Ⅳ分期患者占比均显著低于 Kiss-l 蛋白阴性表达;Cyclin E蛋白阳性表达中有淋巴结转移、Ⅲ + Ⅳ分期患者占比均显著 高于 Cyclin E 蛋白阴性表达(均 P<0.05 )。 结论 结直肠癌组织中 Kiss-1 蛋白低表达，Cyclin E 蛋白高表达，且两者阳性表达均与患者 临床病理特征有关，早期可通过检测上述指标对患者的病情进行判断。
结直肠癌是严重危害人类生命健康的常见消化系统 恶性肿瘤，虽然各种综合治疗手段不断发展，但总体生存 率依旧欠佳，其原因主要是远处转移高发生率及肿瘤局 部高复发率，因此抑制和治疗结直肠癌远处转移是影响患 者预后重要因素。结直肠癌的发生和进展呈多因素、多阶段性，与多个癌基因的激活和过度表达、抑癌基因及脱氧 核糖核酸(DNA)修复基因突变或功能缺失密切相关。目 前，肿瘤细胞形成的分子机制及其与癌基因和抑癌基因 的关系已成为研究热点。吻素 -1(Kiss-1)是从黑色素瘤 细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因，具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，正常情况下 Kiss-1 在正常组织中表达 较多，但在肿瘤组织，特别是消化系统肿瘤，如在胃癌、 食管癌中等表达常常缺失，表明 Kiss-1 参与了肿瘤的发 生、发展过程 [1-2] ，但其具体作用尚不明确。Cyclin E 属于 细胞周期蛋白家族，在正常组织中该蛋白表达较低或不 表达，有报道称，Cyclin E 与恶性肿瘤有关，如乳腺癌中 Cyclin E 过量表达与肿瘤发生及其恶性表型和不良预后密 切相关 [3] 。本研究旨在探究 Kiss-1、Cyclin E 在结直肠癌组 织中的表达情况，现报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 回顾性分析常熟市第一人民医院 2016 年 1 月至 2020 年 3 月收治的 85 例结直肠癌患者的临床资 料，取其结直肠癌组织标本与结直肠癌癌旁正常组织标 本，分别作为结直肠癌组、癌旁组。诊断标准：参照《结 直肠癌诊疗规范(2015 年版)》[4] 中的相关诊断标准。纳 入标准：符合上述诊断标准，并经电子结肠镜检查取活检 病理、影像学检查及术后标本送病理检查等确诊者;年龄 ≥ 18 岁;术前无放化疗、免疫治疗、靶向治疗、中医治 疗等治疗史者;临床资料完整者等。排除标准：多源性肿 瘤或多发癌者;存在炎症性肠病、家族性腺瘤性息肉病 者;合并血液系统、免疫系统疾病者等。院内医学伦理委 员会已批准此研究实施。
1.2研究方法
1.2.1 标本采集 所有手术切除标本包括肿瘤组织和癌旁 正常组织。癌旁正常组织为距癌组织边缘 5 cm 以上的正 常组织，常规进行石蜡阻滞连续切片，切片厚度为 4 μm。
1.2.2 免疫组化检测 采用柠檬酸高温高压对切片进行抗 原修复，加入封闭血清， 室温孵育 30 min，随后弃去血 清，加入抗 Kiss-1 或抗 Cyclin E一抗进行 4 ℃ 过夜孵育， 磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)漂洗 3 次，5 min/ 次，加入二抗 室温孵育 1 h，PBS 漂洗 3 次，5 min/ 次，最后采用 3. 3- 二 氨基联苯胺(DAB)显色，镜下控制反应时间。获得满意 染色效果后，切片自然晾干，采用酒精、二甲苯梯度脱水 透明，中性树脂封片。显微镜下观察 Kiss-1、Cyclin E 的阳 性表达情况。免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有 限公司。以 PBS 代替一抗作阴性对照。
1.2.3 结果判定标准 Kiss-1 表达定位于细胞质和细胞 膜，呈浅黄色、黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。Cyclin E 主 要表达于细胞核内，均表现为棕黄色或黄色颗粒。以染色 强度作半定量评分，Kiss-1 免疫阳性反应物主要着色于胞 浆，Cyclin E 主要着色于胞核，根据染色强度分为：无染 色为 0 分，浅黄色为 1 分，棕黄色为 2 分。根据阳性细 胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例小于 5% 计为 0分，5% ≤阳性细胞所占比例 <25% 计为 1分; 25% ≤阳性 细胞所占比例 <50% 计为 2分; 50% ≤阳性细胞所占比例 <75% 为 3分;阳性细胞所占比例≥75% 计为 4 分。结合 染色强度分数和阳性细胞所占比例分数， 两者相加，>3 分 为阳性表达， ≤ 3 分为阴性表达 [5]。
1.3观察指标 ①观察结直肠癌组织与结直肠癌癌旁 组织 Kiss-1、Cyclin E 表达情况。②分析结直肠癌组织 Kiss-1、Cyclin E 阳性表达与患者临床病理特征的关系。其 中临床病理特征包括年龄、性别、肿瘤直径(<3 cm 或 ≥ 3 cm )、分化程度 [6](高分化： 75% 以上癌细胞分化良 好，呈低度恶性;中分化： 25%~75% 的癌细胞分化良好， 呈中度恶性;低分化：分化良好的癌细胞小于 25%，呈 高度恶性)、浸润深度、神经侵犯(有或无)、脉管侵犯 (有或无)、淋巴结转移(有或无)、远处转移(有或无)、 临床分期 [6] [ 根据 T、N、M 分期综合评估，T 分期(T1、T2、 T3、T4a )、N 分期(N0、N1、N2 )、M 分期(M0、M1 )，包括Ⅰ 期(T1~2、N0、M0 )、Ⅱ期(T3~4b、N0、M0 )、Ⅲ期(T1~4b、N1~2、 M0 )、Ⅳ期(任何 T、任何 N、M1a~1b )]
1.4统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件分析数据， 计量资料经 K-S 法检验均符合正态分布，以 (x ±s) 表示， 行t检验;计数资料以 [ 例 (%)] 表示，两组间比较行χ2 检 验，多组间比较行 χ2 趋势分析。以P<0.05 为差异有统计 学意义。
2 结果
2.1结直肠癌与癌旁正常组织中 Kiss-1、CyclinE蛋白阳 性表达情况比较 结直肠癌组中 Kiss-1 阳性表达患者占 比显著低于癌旁组，Cyclin E 阳性表达患者占比显著高于 癌旁组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表 1.
免 疫组化染色显示，Kiss-1 阳性免疫反应物主要表达在细胞 胞浆，呈现深棕色反应，阳性反应细胞比例约 35%，见 图 1-A;Cyclin E 的阳性免疫反应物主要表达在细胞核，呈 现深棕色反应，细胞核染色较深，阳性反应细胞比例约 60%，见图 1-B。移、Ⅲ + Ⅳ分期患者占比均显著低于 Kiss-l 蛋白阴性表 达;Cyclin E 蛋白阳性表达中有淋巴结转移、Ⅲ + Ⅳ分期 患者占比均显著高于 Cyclin E 蛋白阴性表达，差异均有统 计学意义(均P<0.05)，见表 2.
3 讨论
结直肠癌的发病机制众多，临床治疗靶点有限，探究 新兴研究靶点与已知治疗靶点的相关性，有利于结直肠癌 的精准靶向治疗，因此，在结直肠癌发病早期制定特异性 的诊疗方案和找出能预测患者预后的特异性标志物已成为 癌症治疗的研究热点。
Kiss-1 作为人类肿瘤转移抑制基因，编码 145 个氨基 酸的蛋白质和 19 个氨基酸的信号肽， 定位于 1 号染色体短 臂 3 区 2 带。 Kiss-1 可大量表达于正常组织中，包括中枢 神经系统、消化系统等部位，其中以胎盘组织中的表达水 平最高，而表达缺失主要在多种存在转移的肿瘤组织中， 临床研究已经表明，Kiss-l 与黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱 癌、子宫内膜癌、胃癌等的转移密切相关 [7] 。Kiss-1 基因 首先在黑色素瘤细胞株中发现，其基因表达产物可显著抑 制肿瘤细胞的增殖，同时诱导肿瘤细胞的分化和凋亡 [8] 。 当结直肠癌组织 Kiss-1 表达降低时， 其编码产物多肽与配 体 GPR54 的结合减少， 导致肿瘤细胞的基质金属蛋白酶活 性增强，肿瘤细胞增殖、集落形成能力提高，肿瘤进一步 发生侵袭、转移，导致患者预后较差 [9] 。本研究中，结直 肠癌组中Kiss-1 阳性表达患者占比显著低于癌旁组;Kiss-l 蛋白阳性表达中低分化、有淋巴结转移、Ⅲ + Ⅳ分期患者 占比均显著低于 Kiss-l 蛋白阴性表达，提示 Kiss-1 蛋白在 结直肠癌组织中呈低表达， 且 Kiss-1 的表达水平与肿瘤分 化程度、淋巴结转移、临床分期有关。因此，监测 Kiss-1 蛋白表达有希望成为评估结肠癌高危因素和恶性生物学行 为的标志物。
Cyclin E 主要表达于细胞核， 是细胞周期 G1 期的正向 调节因子， 其调控细胞增殖主要是通过缩短 G1 期，引起中 心体过增殖，干扰有丝分裂，形成不稳定的染色体，从而 诱发肿瘤形成 [10]。本研究中， 结直肠癌组中 Cyclin E 阳性表达患者占比显著高于癌旁组;Cyclin E 蛋白阳性表达中 有淋巴结转移、Ⅲ + Ⅳ分期患者占比均显著高于 Cyclin E 蛋白阴性表达，提示 Cyclin E 蛋白在结直肠癌组织中呈高 表达，且 Cyclin E 的表达水平与淋巴结转移、临床分期有 关。相关研究中，Cyclin E 的高表达对细胞的凋亡产生抑 制作用，不仅提高结直肠癌细胞的生存能力，还参与结直 肠癌的侵袭和转移，其表达水平可能成为判断结直肠癌预 后的潜在指标 [11]。张庚等 [12] 研究结果显示， 在结肠镜所取 结直肠癌组织中 Cyclin E 阳性率为 66.3%，而邻近正常黏膜组织中 Cyclin E 阳性率仅为 23.7%，并且结直肠癌组织 中其表达与原发肿组织分化、临床分期呈显著正相关，说 明 Cyclin E 过度表达可能与结直肠癌的发生及进展有关。
综上， Kiss-1 蛋白在结直肠癌组织中呈低表达， Cyclin E 蛋白在结直肠癌组织中呈高表达，且 Kiss-1、 Cyclin E 的表达水平与患者临床病理特征有关，早期可通 过检测上述指标对患者的病情进行判断，为临床后续治疗 提供一定的参考依据。
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