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【摘要】 目的：探讨芝麻酚对体外培养人结肠癌 HCT-8 细胞的影响及其机制。方法： 体外培养人结肠癌 HCT-8 细胞，分为对照组、 芝麻酚 50μmol/L 组、芝麻酚 100μmol/L 组和芝麻酚 250 μmol/L 组共 4 组，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测各组不同作用时间细 胞增殖率，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组 Janus 激酶 2/ 信号转导与转录激活因子 3(JAK2/STAT3)信号通路相关蛋白、增殖相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平。结果： 经芝麻酚处理 24、48、72 h 后，HCT-8 细胞的 OD 值从高到低依次为对照组 > 芝麻酚 50 μmol/L 组 > 芝麻酚 100 μmol/L 组 > 芝麻酚 250 μmol/L 组，HCT-8 细胞的抑制率从低到高依次为对 照组 < 芝麻酚 50 μmol/L 组 < 芝麻酚 100 μmol/L 组 < 芝麻酚 250 μmol/L 组， 差异有统计学意义( P<0.05); 经芝麻酚处理后 HCT-8 细胞 凋亡率从低到高依次为对照组 < 芝麻酚 50 μmol/L 组 < 芝麻酚 100 μmol/L 组 < 芝麻酚 250 μmol/L 组，差异有统计学意义( P<0.05); 各组 JAK2/GAPDH 和 STAT3/GAPDH 蛋白表达水平比较， 差异均无统计学意义(P>0.05); 芝麻酚处理后 HCT-8 细胞中 p-JAK2/JAK2 和 p-STAT3/ STAT3 蛋白表达水平从高到低依次为对照组 > 芝麻酚 50 μmol/L 组 > 芝麻酚 100 μmol/L 组 > 芝麻酚 250 μmol/L 组，差异有统计学意义 (P <0.05); 芝麻酚处理后 HCT-8 细胞中细胞周期蛋白 D1(cyclin D1)、c-Myc 和 B 细胞淋巴瘤 -2(Bcl-2)蛋白表达水平从高到低依次为对照 组 > 芝麻酚 50 μmol/L 组 > 芝麻酚 100 μmol/L 组 > 芝麻酚 250 μmol/L 组， 差异有统计学意义( P<0.05); 芝麻酚处理后 HCT-8 细胞中 Bax 蛋白表达水平从低到高依次为对照组 < 芝麻酚 50 μmol/L 组 < 芝麻酚 100 μmol/L 组 < 芝麻酚 250 μmol/L 组，差异有统计学意义( P<0.05)。
结论： 不同剂量芝麻酚均对体外培养人结肠癌 HCT-8 细胞具有抑制增殖、诱导凋亡作用，其机制可能与抑制 JAK2/STAT3 信号通路的激活有关。
【关键词】 芝麻酚,结肠癌,体外培养,人 HCT-8 细胞,JAK2/STAT3 信号通路,细胞周期蛋白 D1
Effects of Sesamol on human colon cancer HCT-8 cells cultured in vitro and its mechanism
LIU Yanbo1. ZHANG Baocheng2*
(1. 3rd Oncology Department of Jiamusi City Cancer Hospital, Jiamusi 154000 Heilongjiang, China;
2. Basic Medical College of Jiamusi University, Jiamusi 154007 Heilongjiang, China)
【 Abstract 】Objective: To investigate effects of Sesamol on human colon cancer HCT-8 cells cultured in vitro and its mechanism. Methods: Human colon cancer HCT-8 cells were cultured in vitro and were divided into four groups: control group, 50 μmol/L Sesamol group, 100 μmol/L Sesamol group and 250 μmol/L Sesamol group. The cell proliferation rate of each group was detected and compared by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric method, and the apoptosis rate of each group was detected and compared by flow cytometry. Western blotting was used to detect and compare the expression levels of JAK2/STAT3 signaling pathway-related proteins, proliferation-related proteins and apoptosis-related proteins in each group at different time points. Results: After treatment with Sesamol for 24.48 and 72 h, the OD value of HCT-8 cells from high to low was control group > 50 μmol/L Sesamol group > 100 μmol/L Sesamol group > 250 μmol/L Sesamol group; the inhibition rate of HCT-8 cells from low to high was control group < 50 μmol/L Sesamol group < 100 μmol/L Sesamol group < 250 μmol/L Sesamol group; and the differences were statistically significant (P<0.05). The apoptosis rate of HCT-8 cells treated with Sesamol from low to high was control group < 50 μmol/L Sesamol group < 100 μmol/L Sesamol group < 250 μmol/ L Sesamol group, and the differences were statistically significant (P<0.05). There were no significant differences in the expression levels of JAK2/GAPDH and STAT3/GAPDH in each group (P>0.05). The expression levels of p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 in HCT-8 cells treated with Sesamol from high to low were control group > 50 μmol/L Sesamol group > 100 μmol/L Sesamol group > 250 μmol/L Sesamol group, and the differences were statistically significant (P<0.05). The expression levels of cyclin D1. c-Myc and Bcl-2 in HCT-8 cells treated with Sesamol were control group > 50 μmol/L Sesamol group > 100 μmol/ L Sesamol group > 250 μmol/L Sesamol group, and the differences were statistically significant (P<0.05). Further, the expression level of Bax in HCT-8 cells treated with Sesamol from low to high was control group < 50 μmol/L Sesamol group < 100 μmol/L Sesamol group < 250 μmol/L Sesamol group, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusions: Different doses of Sesamol can inhibit the proliferation and induce apoptosis of human colon cancer HCT-8 cells cultured in vitro. The mechanism may be related to the inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway activation.
【Keywords】 Seasamol; Colon cancer; In vitro culture; Human HCT-8 cell; JAK2/STAT3 signaling pathway; Cyclin D1
结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率和 死亡率在全部恶性肿瘤中分别居第 3 位和第 2 位 [1]。 手术切除、放化疗、靶向治疗等为结肠癌的主要 治疗手段，但 5 年生存率较低 [2] 。芝麻酚提取于芝 麻，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗癌等作用，可以 通过干扰 DNA 的复制和(或)修复过程，影响细 胞周期，导致 G1/S 期阻滞，发挥抑制细胞增殖作 用 [3]。已知 Janus 激酶 2/ 信号转导与转录激活因子3 (JAK2/STAT3)信号通路在结肠癌中被异常激活， 并参与癌细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡等过程 [4]。 本文探讨芝麻酚对体外培养人结肠癌 HCT-8 细胞 的影响及其机制。
1 资料与方法
1.1 材料与仪器 人结肠癌 HCT-8 细胞(上海雅 吉生物科技有限公司) ;芝麻酚 [ 铼博(上海)生 化科技有限公司 ];RPMI 1640 培养基、胎牛血清 [ 沃卡威(北京)生物技术有限公司 ];四甲基偶 氮唑盐(MTT，上海联硕生物科技有限公司) ;流 式细胞仪及分析软件(长沙市微米生物科技有限公 司) ; Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(武 汉普诺赛生命科技有限公司) ;全自动蛋白印迹系 统 (金斯瑞生物科技有限公司) ;酶标仪(上海 科华实验系统有限公司) ; HERAcell 240i CO2 恒温 细胞培养箱(赛默飞世尔科技公司) ;蛋白质电泳 仪(北京六一生物科技有限公司) ;蛋白质转膜仪 (北京六一生物科技有限公司);原癌基因(c-Myc)、 细胞周期蛋白 D1( cyclin D1 ) 、B 细胞淋巴瘤 -2 ( Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)抗体，兔抗 磷酸化 JAK2(p-JAK2)、p-STAT3、辣根过氧化 物酶(HRP) 标记山羊抗兔 IgG， 以及兔抗 GAPDH (南京巴傲得生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞株 HCT-8 采用含 有 10% 胎 牛 血 清、100 U/mL 链 霉 素 与 青 霉 素 的 RPMI 1640培养液，在37 ℃、5% CO2 培养箱中培养， 每 2 d 进行 1 次传代。
1.2.2 MTT 法测定 HCT-8 细胞增殖率 收集对数 生长期 HCT-8 细胞， 以 2000 μL/ 孔接种于 96 孔 板， 分为对照组、 芝麻酚 50 μmol/L 组、芝麻酚 100 μmol/L 组和芝麻酚 250 μmol/L 组每组设 8 个复孔， 待细胞贴壁后除对照组外， 芝麻酚 50 μmol/L 组、芝麻酚 100 μmol/L 组和芝麻酚 250 μmol/L 组 给药 24、48 和 72 h 后， 均每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养 4 h，采用酶标仪检测 490 nm 波 长处各孔的吸光度(OD)值，其中，吸光值越高， 细胞活力越高，细胞增殖能力越强。
1.2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡率 收集各组对数 生长期 HCT-8 细胞， 用 50、100 和 250 μmol/L 芝 麻酚处理 HCT-8 细胞 48 h 后，收集细胞，经预冷 的磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗后重悬收集细胞， 然后在 PBS 洗涤 3 次后加入 Annexin V-FITC 混匀， 染色 20 min，再加入碘化丙啶(PI) ，染色，使用 流式细胞仪测定荧光强度以观察细胞凋亡率。
1.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各 组蛋白表达水平 收集对数生长期 HCT-8 细胞， 用 50、100 和 250 μmol/L 芝麻酚处理 HCT-8 细胞 48 h 后，胰酶消化收集细胞，提取总蛋白并测定浓 度。按照 Western blotting 试剂盒说明书操作， 于每 孔加入蛋白溶液 50 μg 行电泳分离后转膜，经 5% 脱脂奶粉封闭，采用兔抗人单克隆一抗孵育过夜， 经 TBST 洗涤， 加入 HRP 标记的山羊抗兔二抗， 孵 育 2 h 后成像，扫描图像并测定各条带的灰度值。 1.3 观察指标 ( 1 )比较各组不同作用时间 HCT-8 细胞的增殖率。(2) 比较各组 HCT-8 细 胞 的 凋 亡 率。(3) 比 较 各 组 HCT-8 细 胞 JAK2/ STAT3 信号通路相关蛋白表达水平。(4)比较各 组 HCT-8 细胞增殖相关蛋白和凋亡相关蛋白表达 水平。
1.4 统计学方法 应用 SPSS 25.0 软件进行统计学 分析，计量资料以( x(—) ±s )表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用 F 检验，以 P<0.05 为差异 有统计学意义。
2 结果
2.1 各组不同作用时间 HCT-8 细胞的增殖率比 较 经芝麻酚处理 24、48、72 h 后， HCT-8 细胞的 OD 值从高到低依次为对照组 > 芝麻酚 50 μmol/L 组 > 芝麻酚 100 μmol/L 组 > 芝麻酚 250 μmol/L 组， HCT-8 细胞的抑制率从低到高依次为对照组 < 芝 麻酚 50 μmol/L 组 < 芝麻酚 100 μmol/L 组 < 芝麻 酚 250 μmol/L 组， 差异有统计学意义( P<0.05 )。见表 1.
2.2 各组 HCT-8 细胞凋亡率比较 经芝麻酚处理 后 HCT-8 细胞凋亡率从低到高依次为对照组 < 芝 麻酚 50 μmol/L 组 < 芝麻酚 100 μmol/L 组 < 芝麻 酚 250 μmol/L 组， 差异有统计学意义( P<0.05 )。 见表 2.
2.3 各组 HCT-8 细胞 JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白 表达水平比较 各组 JAK2/GAPDH 和 STAT3/GAPDH 水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05); 芝麻 酚 处 理 后 HCT-8 细 胞 中 p-JAK2/JAK2 和 p-STAT3/ STAT3 蛋白表达水平从高到低依次为对照组 > 芝 麻 酚 50 μmol/L 组 > 芝 麻 酚 100 μmol/L 组 > 芝 麻 酚 250 μmol/L 组， 差异有统计学意义( P<0.05 )。 见表 3.
2.4 各组 HCT-8 细胞增殖相关蛋白和凋亡相关 蛋白表达水平比较 芝麻酚处理后 HCT-8 细胞中 cyclin D1、c-Myc 和 Bcl-2 蛋白表达水平从高到 低依次为对照组 > 芝麻酚 50 μmol/L 组 > 芝麻酚 100 μmol/L 组 > 芝 麻 酚 250 μmol/L 组; 芝 麻 酚 处理后 HCT-8 细胞中 Bax 蛋白表达水平从低到 高依次为对照组 < 芝麻酚 50 μmol/L 组 < 芝麻酚 100 μmol/L 组 < 芝麻酚 250 μmol/L 组， 差异有统 计学意义(P<0.05)。见表 4.
3 讨论
结肠癌的发生主要与生活习惯、遗传易感性等 因素相关 [5] ，因其侵袭性强、易复发与转移、易耐 药的特点， 5 年生存率仍较低 [6] 。因此，亟需寻求 更安全可靠的临床治疗方法。
芝麻酚是芝麻中的抗氧化成分，具有抑菌、抗 氧化、清除自由基、防止肿瘤发生等作用。同时， 芝麻酚能够通过介导线粒体凋亡等信号途径诱导皮 肤癌、黑色素瘤、舌鳞癌等细胞凋亡 [7-9] 。本研究结果显示， 经芝麻酚处理 24、48、72 h 后， HCT-8 细胞的 OD 值随芝麻酚剂量增加而降低，而 HCT-8 细胞的抑制率、凋亡率随芝麻酚剂量增加而上升， 这一结果与文献报道相吻合 [10] 。提示芝麻酚可抑制 体外培养人结肠癌 HCT-8 细胞的增殖，并诱导其 凋亡。
已知 JAK2/STAT3 信号通路以磷酸化的形式在 结肠癌中异常活化，并可刺激结肠癌的增殖、侵袭 和转移 [11] 。STAT3 是 STATs 家族的成员， 已被证 实为癌基因，能够诱导细胞过度增殖分化，并抑制 其凋亡 [12] ;JAK2 位于 STAT3 的上游， 结肠癌的进 展与 p-JAK2 和 p-STAT3 的高表达以及 STAT3 下 游 cyclin D1、c-Myc、Bcl-2 等靶基因的激活有关。 Cyclin D1 可加速细胞周期， 促进细胞增殖;c-Myc 可促进细胞分裂，并可诱导细胞过度增殖分化; Bcl-2 属于一种抗凋亡因子，而 Bax 属于促凋亡因 子。本研究结果同时显示，芝麻酚处理后 HCT-8 细胞中 p-JAK2/JAK2、 p-STAT3/STAT3、cyclin D1、 c-Myc 和 Bcl-2 蛋白表达水平随芝麻酚剂量的增加 而降低， Bax 蛋白表达水平随芝麻酚剂量的升高而 升高。提示芝麻酚可能通过调节 JAK2/STAT3 信号 通路， 下调 cyclin D1、c-Myc 蛋白的表达， 而抑 制结肠癌 HCT-8 细胞的增殖，并通过下调 Bcl-2 蛋白的表达，而上调 Bax 蛋白表达以诱导结肠癌 HCT-8 细胞凋亡。
综上所述，不同剂量芝麻酚均对体外培养人结 肠癌 HCT-8 细胞具有抑制增殖、诱导凋亡作用，其 机制可能与抑制 JAK2/STAT3 信号通路的激活有关。
参考文献
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