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摘 要： 目的 去泛素化酶（USP）通过去除底物的泛素部分，调节蛋白质活性和细胞的稳态。泛素化特异性蛋白酶 7（USP7）是去泛素化蛋白酶家族中的一员，与多种肿瘤的发生发展密切相关。目前研究发现 USP7 在多种肿瘤组织中呈现高表达，且其高表达与患者临床病理特征及不良预后密切相关。然而 USP7 在 HBV 相关肝癌中的作用目前尚未报道。我们旨在探究 USP7 在 HBV 相关肝癌中的表达水平及预测价值。方法 我们通过免疫组织化学的方法对 65 例 HBV 相关肝癌瘤体的石蜡切片中的 USP7 蛋白进行检测，t 检验分析 USP7 在癌及癌旁中表达，χ 2 检验评估 USP7 表达与临床病理参数间的相关性，Kaplan-Meier 法评估生存期。结果 研究表明，USP7 蛋白在 HBV 相关肝癌患者组织中高表达，且与患者肿瘤大小、数量及不良预后正相关。结论 我们认为 USP7 可能是 HBV 相关肝癌患者生存预后的预测因子，或许能成为 HBV 相关肝癌疾病诊断和治疗的新靶点。
关键词： USP7；HBV 相关肝癌；肿瘤发生
Highly Expression of USP7 in HBV-associated Liver Cancer and Suggests a Poor Prognosis
WU Sheng-qiang
(Guilin Metallurgical Sanatorium, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin, Guangxi, 541003)
ABSTRACT： Objective To deubiquitinase (USP) regulate protein activity and cell homeostasis by removing the ubiquitin portion of the substrate. Ubiquitin-specific protease 7 (USP7) is a member of the deubiquitinating protease family and is closely related to the development of various tumors. The current study found that USP7 is highly expressed in a variety of tumor tissues, and its high expression is closely related to the clinicopathological features and poor prognosis of patients. However, the role of USP7 in HBV-associated liver cancer has not been reported yet. It aimed to investigate the expression level and predictive value of USP7 in HBV-associated liver cancer. Methods USP7 protein was detected by immunohistochemistry in paraffin sections of 65 HBV-associated liver cancer tumors. The expression of USP7 in cancer and adjacent tissues was analyzed by t-test. The correlation between USP7 expression and clinical pathological parameters was evaluated by χ 2 test. Using the sex, Kaplan-Meier method to assess survival. Results The study showed that USP7 protein was highly expressed in the tissues of HBV-related liver cancer patients, and it was positively correlated with tumor size, number and poor prognosis. Conclusion It believes that USP7 may be a predictor of survival prognosis in patients with HBV-related liver cancer, and may be a new target for the diagnosis and treatment of HBV-related liver cancer diseases.
KEY WORDS： USP7; HBV-related liver cancer; Tumorigenesis
0引言
肝癌发病的主要危险因素包括慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、糖尿病、黄曲霉毒素暴露、肝硬化及吸烟等[1-3]。在中国，约有 75-85% 的肝癌患者是由于慢性乙型肝炎病毒感染导致 [4]。近年来，已有大量文献报道 HBV 通过干扰宿主细胞基因转录、信号转导、蛋白质分解、DNA 修复和染色体稳定性等机制引起肝癌的发生，HBV 感染在肝癌的发生、发展、侵袭转移中发挥着极为重要的作用 [5-6]。目前关于 HBV 相关肝癌的诊断及治疗远未达到令人满意的效果，大多 HBV 相关肝癌患者在中晚期才被确诊，治疗仍以手术切除为主，但总体治疗效果仍不理想，生存率依旧较低 [7-8]。因此寻找 HBV 相关肝癌新的分子标记物，明确其具体作用机制，对于临床诊断及治疗的指导十分迫切。
USP7 位于许多信号通路的关键节点，通过调控抑癌蛋白、DNA 修复蛋白、免疫应答子、病毒蛋白和表观遗传修饰蛋白等生物活性，从而参与细胞等生命活动中。研究表明， USP7 蛋白在多种恶性肿瘤如肝细胞癌、多发性骨髓瘤、结肠癌、肺癌及前列腺癌等癌组织中高表达，而且这种高表达与肿瘤的发生发展呈正相关，提示其癌基因的作用 [9-10]。然而， USP7 在 HBV 相关肝癌患者组织中的表达水平及其意义目前尚未见有关报道。
1资料与方法
1.1一般资料。所有的肝癌患者的临床组织样本均取自于2012 年至 2016 年手术切除标本，并对其临床病理资料以及生存预后进行整理及分析。
1.2免疫组化。石蜡切片经二甲苯脱蜡后，梯度乙醇对其进行再水化。将切片浸入 3% H2O2 中，以抑制内源性的过氧化物酶，EDTA 进行抗原修复。用免疫组化笔画圈，一抗 4℃ 孵育 1 过夜，PBS 冲洗 3 次。二抗室温孵育 30 min，PBS 冲洗 3 次。DAB 染色 1 min，苏木素复染核 1 min，0.1% HCl 酒精分化 1s，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.3评分标准。染色强度评分标准如下：0，无染色；1+， 轻度染色；2+，中度染色；3+，重度染色。染色面积评分标 准如下：0，镜下无任何染色；1+，<30% 组织染色呈阳性； 2+，30%-60% 组织呈阳性；3+，>60% 组织染色呈阳性。以染色强度和染色面积的综合评分评估 USP7 的表达情况，最高分为 6 分，最低分为 0 分。USP7 染色阳性的标准为细胞核中出现棕色着色。
1.4数据分析。SPSS 18.0 软件分析并统计实验数据。t 检验分析 USP7 在癌及癌旁中表达，χ 2 检验评估 USP7 表达与临床病理参数间的相关性 Kaplan-Meier 法评估生存期，组间差异P< 0.05 时具有统计学意义。
2结果
2.1USP7 在 HBV 相关肝癌组织中高表达。我们对 65例HBV 相关肝癌瘤体的石蜡切片进行 USP7 的免疫组织化学检测， 结果显示阳性 USP7 蛋白染色主要位于细胞核（图1A），并在癌组织中呈高表达，而癌旁组织呈低表达（P< 0.001）（图 1B）。
2.2USP7 与 HBV 相关肝癌患者不良临床预后相关。我们将 USP7 在 HBV 相关肝癌组织中的表达水平分为高表达组（n =39）和低表达组（n =26）。通过卡方检验发现 USP7 的表达与 HBV 相关肝癌的 Tumor size（P< 0.05）、Tumor number（P< 0.05）相关（表 1）。我们进一步通过 Kaplan- Meier 生存曲线分析了 USP7 表达与 HBV 相关肝癌患者临床预后的相关性。结果显示，USP7 高表达组患者的总体生存时间低于 USP7 低表达组（图 2A），同时，无复发生存时间也低于 USP7 低表达组（图 2B）。我们结果表明，HBV 相关肝癌中 USP7 的高表达与患者肿瘤恶性程度和不良临床预后相关。
3讨论
慢性乙肝病毒感染是肝癌发病的主要类型之一，尤其在中国，因其肿瘤进展迅速，早期诊断困难，死亡率高率 [5]， 对人类生命产生严重威胁。目前寻找 HBV 相关肝癌发生发展的关键调节因素，并用以指导临床的诊断和治疗仍然是研究的热点。USP7 是泛素特异性水解酶之一，其在多种恶性肿瘤中都有表达，近年来有研究表明 USP7 在肿瘤细胞生长过程中起到关键作用，其可以调控基因的复制和表达，从而调控细胞周期，USP7 缺乏的癌细胞出现细胞生长缓慢和停滞的现象 [11-12]。USP7 作为去泛素化酶家族中的重要一员， 可参与生物体内一系列生化反应，同时，也成为近年来肿瘤标记物的研究热点。
之前有研究表明 USP7 在肝癌组织中呈现高表达，且与肝癌的发生发展及患者临床预相关，并可以作为预测肝癌患者生存及预后的生物标志物 [9-10]。在本研究中，我们将 HBV 相关肝癌作为分析对象，验证 USP7 与HBV 相关肝癌的关系。我们研究证实 USP7 在 HBV 相关肝癌组织中呈高表达，且与肿瘤发生发展及患者预后不良呈正相关。
因此，我们认为 USP7 可以促进慢性乙肝转向肝癌这一进程， USP7 可能是 HBV 相关肝癌患者生存和预后的预测因子，并可作为 HBV 相关肝癌诊断和治疗的分子靶标。
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