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摘要：目的通过GM-CSF联合5-FU作用于SGC7901胃癌细胞，以初步探究其对胃癌细胞凋亡和周期有何影响，为临床胃癌化疗的联合用药提供参考依据。方法体外培养胃癌SGC7901细胞，Annexin V-FITC/PI流式检测细胞凋亡情况，PI流式检测细胞周期情况。结果Annexin V-FITC/PI流式检测结果显示5-FU能显著诱导胃癌细胞凋亡，而加入GM-CSF后抵抗了5-FU诱导的凋亡(P<0.05)。流式周期结果显示5-FU和GM-CSF均能导致胃癌细胞周期阻滞，并且两者具有互相拮抗作用。结论GM-CSF能够有效抑制5-FU诱导的胃癌细胞凋亡和周期阻滞，在增强胃癌细胞5-FU化疗耐药性方面具有重要作用。
关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；胃肿瘤；细胞凋亡；细胞周期；耐药性；氟尿嘧啶
本文引用格式：常仕林，蔡辉.GM-CSF联合5-FU对胃癌细胞凋亡和周期的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(98):287-289.
Effects of GM-CSF combined with 5-FU on Apoptosis and Cell Cycle of Gastric Cancer Cells
CHANG Shi-lin,CAI Hui*
(Ningxia Medical University,Yinchuan Ningxia)
ABSTRACT:Objective The effect of GM-CSF combined with 5-FU on SGC7901 gastric cancer cells was to explore its effect on the apoptosis and cycle of gastric cancer cells,and provide a reference for the combination of clinical gastric cancer chemotherapy.Methods Gastric cancer SGC7901 cells were cultured in vitro,apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI flow cytometry,and cell cycle was detected by PI flow cytometry.Results Annexin V-FITC/PI flow cytometry showed that 5-FU significantly induced apoptosis in gastric cancer cells,while GM-CSF was added to resist 5-FU-induced apoptosis(P<0.05).The results of flow cycle showed that both 5-FU and GM-CSF can cause cell cycle arrest in gastric cancer,and the two have antagonistic effects.Conclusions GM-CSF can effectively inhibit 5-FU-induced gastric cancer cell apoptosis and cell cycle arrest,and plays an important role in en-hancing 5-FU chemoresistance in gastric cancer cells.
KEY WORDS:Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor;Stomach neoplasms;Apoptosis;Drug resistance;Cell cycle;Fluorouracil
0引言
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）是一种造血细胞增殖和分化刺激因子[1]。越来越多的研究发现肿瘤细胞能够自分泌GM-CSF，对肿瘤细胞的增殖力、侵袭力和耐药性会产生影响[2-4]。氟尿嘧啶（5-fu）是胃癌一线化疗方案中的常用药和基础药物[5]。自1957年被合成以来，就作为化疗药被广泛应用于胃肠道肿瘤和其他常见肿瘤中[6]。5-fu作为化疗单药治疗胃癌的效率比较低，可能与胃癌对5-fu敏感性比较低有关。从上世纪80年代开始，以5-fu为基础的联合化疗方案在临床上得到广泛的运用。最常见的有顺铂联合5-FU，多西他赛联合顺铂和5-FU，紫杉醇联合顺铂和5-fu等等[7,8]。化疗的联合用药可以提高药物疗效和减少副作用，也有可能降低化疗敏感性增加胃癌耐药性。但是，GM-CSF联合5-fu对胃癌的治疗有何影响，目前的研究资料还极少。因此，本实验采用GM-CSF联合5-FU作用于SGC7901胃癌细胞，以初步探究其对胃癌细胞凋亡和周期有何影响。
1材料与试剂
1.1细胞株
人胃癌SGC7901细胞来源于中国科学院兰州分院空间辐射生物学实验室。
1.2主要试剂
RPMI-1640培养基和胎牛血清购于新西兰Hyclone公司；胰蛋白酶购于美国Amresco公司；GM-CSF购于美国Peprotech公司；5-FU购自上海旭东海普公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。
1.3主要仪器
细胞恒温培养箱、高速台式离心机（赛默飞世尔科技公司），DMIL-BFC295倒置显微镜（德国Leica公司），FlowSight流式细胞仪（德国Merck-Millipore公司）。
2实验方法
2.1细胞培养及药物配制
对数生长期胃癌SGC7901细胞，含10%胎牛血清的完全培养基，于恒温37.5℃、5%CO2的培养箱中培养。人重组GM-CSF溶解浓度为4 mg/L，于-80℃保存，工作液浓度为20μg/L。5-FU母液质量浓度为25 g/L，于4℃保存。
2.2实验分为四组
GM-CSF刺激组，加入20μg/L GM-CSF刺激；5-FU诱导组，加入16 mg/L（IC50）5-FU诱导；GM-CSF刺激联合5-FU诱导组（联合组），同时加入16 mg/L 5-FU和20μg/L GM-CSF；空白对照组，加等量培养基，未做其他处理。
2.3凋亡情况观察
细胞接种在35 mm培养皿，各组细胞培养48 h后拍照，倒置相差显微镜下观察细胞凋亡情况并进行序列摄影。收集细胞，用0.25%不含EDTA胰酶制成单细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，PBS洗涤。加入100μl Binding Buffer和1μl FITC标记的Annexin V，室温避光孵育15 min。加入2μl PI室温孵育5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。
2.4周期情况观察
细胞接种在35 mm培养皿，各组细胞培养48h后收集细胞，用0.25%不含EDTA胰酶制成单细胞悬液，1200r/min离心5 min，PBS洗涤。弃上清液后加入300ul冷PBS和800ul无水乙醇-20°C过夜。2000r/min离心5 min，加入PI浓度为15ug/mL的PBS稀释液100μL重悬细胞，室温避光孵育5 min上流式细胞仪检测细胞周期。
3统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行数据分析，多个样本计量资料的比较采用单因素方差分析，两样本均数比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
4结果
4.1GM-CSF对5-FU诱导的细胞凋亡具有抑制作用
显微镜下观察发现，空白对照组和GM-CSF刺激组未出现明显凋亡，5-FU诱导组联合组凋亡细胞数量有所降低（图1）。流式细胞仪检测发现，细胞凋亡明显，相比于5-FU诱导组，与空白对照组的1.9%相比，GM-CSF刺激组凋亡率降低（1.0%），5-FU诱导组凋亡率增加（28.3%），而联合组凋亡率为19.1%，显著低于5-FU诱导组（图2）。
4.2GM-CSF拮抗5-FU诱导的细胞周期阻滞
流式细胞周期检测结果发现，与空白对照组相比，5-FU诱导组G0/G1期细胞数量明显升高，比例为75.46±1.19%（*P<0.05）。GM-CSF刺激组G2/M期细胞数量明显升高，比例为32.27±0.45%（*<0.05），而联合组既显著降低了5-FU诱导组的G0/G1期细胞阻滞数量（62.98±0.43*%）又降低了GM-CSF
刺激组G2/M期细胞阻滞数量（16.31±0.48*%）。表明GM-CSF能有效拮抗5-FU对胃癌细胞的周期阻滞作用。见图
5 讨论
GM-CSF是主要造血细胞生长因子之一[9]在临床研究中发现，当胃癌组织产生大量GM-CSF的时候，5-FU化疗对肿瘤的杀伤效果往往有弱化的趋势。但是，相关机制目前还不清楚。丁欣研究发现GM-CSF对结肠癌5-FU化疗的耐药性有着重要作用[10]。Revoltella等研究发现，GM-CSF在恶性胶质瘤细胞中具有预防肿瘤细胞凋亡的作用[11]。那么，GM-CSF对5-FU化疗诱导的胃癌细胞凋亡有何作用呢？本论文通过细胞形态学观察和流式细胞术检测凋亡时发现，相比于5-FU诱导组，联合组凋亡细胞数量及凋亡率有所降低，GM-CSF可以抑制5-FU诱导的细胞凋亡。除了凋亡，我们还研究了GM-CSF对5-FU化疗诱导的胃癌细胞周期阻滞的影响。从周期结果我们可以发现，5-FU能导致胃癌细胞周期阻滞在G0/G1期，GM-CSF能导致胃癌细胞周期阻滞在G2/M期。两者联合应用则显著降低由5-FU导致的
G0/G1期阻滞比例至62.98±0.43%，又显著降低由GM-CSF导致的G2/M期阻滞比例至16.31±0.48%。可见，在细胞周期阻滞方面，GM-CSF和5-FU具有相互拮抗的作用。综上所述，无论是在胃癌细胞凋亡方面还是周期阻滞方面，GM-CSF和5-FU都具有相互拮抗的作用。因此，GM-CSF和5-FU化疗的联合用药可能降低化疗敏感性同时增加胃癌耐药性，对临床上胃癌化疗的联合用药和化疗并发症防治方面具有重要参考价值。
参考文献
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耐药细胞株的micro-RNA表达谱[D].复旦大学,2012.
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[8]张少君,杨洁,廖雪梅,等.贝伐珠单抗与多西紫杉醇联合5-FU及顺铂化疗治疗晚期胃癌的临床效果[J].肿瘤药学,2018,8(06):976-8+1005.
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[10]丁欣.KRAS突变型结肠癌化疗耐药的新机制[D].安徽医科大学,2018.
[11]REVOLTELLA R P,MENICAGLI M,CAMPANI D.Granulocyte–macro-phage colony-stimulating factor as an autocrine survival-growth factor in human gliomas[J].Cytokine,2012,57(3):
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