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摘要：心肌细胞缺氧/复氧模型（hypoxia/re-oxygenation，H/R）是体外从细胞水平研究心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）的理想模型，在MI/RI科学研究中发挥着重要作用。文中分别对物理性及化学性等方法构建的H/R模型进行整理总结，阐述各模型的造模方法，比较各模型的优缺点，为客观、合理地选择与建立H/R模型提供参考。
关键词：心肌细胞；缺氧复氧；物理性；化学性
本文引用格式：宁小伟,苏和,张瑞芬.不同方法构建的心肌细胞缺氧/复氧模型[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(93):93-94.
Hypoxia/reoxygenation Models of Cardiomyocytes Constructed by Different Methods
NING Xiao-wei1,SU He2,ZHANG Rui-fen2*
(1.Inner Mongolia Medical University,Hohhot Inner Mongolia;2.Intensive Care Unit,Inner Mongolia Traditional Chinese Medicine Hospital,Hohhot Inner Mongolia)
ABSTRACT:Hypoxia/re-oxygenation(H/R)model of cardiomyocytes is an ideal model to study myocardial ischemia/reperfusion injury-reperfusion injury(MI/RI)from the cell level in vitro,which played an important role in the research of MI/RI science.In this paper,it summarizes the H/R model constructed by physical and chemical methods,expounds the modeling methods of each model,compares the advantages and disadvantages of each model,and provides a reference for researchers to select and establish the H/R model objectively and reasonably.
KEY WORDS:Cardiomyocytes;Hypoxia reoxygenation;Physical property;Chemical property
0引言
2017年中国心血管病报告指出，从总体上看，中国心血管病（cardiovascular disease，CVD）患病率及死亡率仍呈上升趋势，急性心肌梗死死亡率呈快速上升态势，城市为56.38/10万，农村为70.09/10万[1]。随着再灌注技术的推广应用，可挽救濒死心肌，明显改善患者的临床症状并降低急性心肌梗死的死亡率，但随之发生的心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）也成为困扰临床医生的一大难题[2]。因此，构建合适的H/R模型是MI/RI研究的首要条件，在MI/RI的机制及探索其防治方法中具有重要意义。本文就多种H/R模型的构建方法作一综述，期望为深入研究其发病机制以及探索有效干预药物提供参考。
1物理性H/R模型
物理性H/R模型的方法主要有混合气体培养法（三气培养箱、厌氧袋、厌氧罐法、低氧/厌氧工作站）、液体石蜡封闭法和安宁包厌氧法等。
1.1混合气体培养法
1.1.1三气培养箱
杜芳等[3]采用体外原代培养乳鼠心肌细胞，将心肌细胞培养至第5天进行干预，缺氧过程：将细胞置入1%O2、5%CO2、37℃三气培养箱内无糖无血清依次培养1、2、3、4h，再复氧过程：更换含10%胎牛血清低糖DMEM培养基正常培养6h，建立乳鼠心肌细胞H/R模型，通过观察细胞一般形态和超微结构、细胞损伤酶活性以及细胞凋亡率，证实通过物理性缺氧造模，该模型可靠稳定，重复性好，且缺氧时间以3h为宜。
1.1.2厌氧袋、厌氧罐法
厌氧袋/厌氧罐法，其原理是根据厌氧菌的培养方法，厌氧袋内有气体发生装置、指示剂，消耗培养罐内的氧气，并释放CO2，制造缺氧环境，主要通过指示剂颜色变化来判断缺氧情况（无氧状态：O2<0.1%，浅色调-粉红色；有氧状态：O2>0.5%，深色调-紫色）[4]。陈俭琴等[5]采用厌氧产气袋-缺氧密闭系统造成细胞缺氧环境，建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型，对培养至第5d的心肌细胞进行干预，将细胞悬于无血清、无糖DMEM培养液中，将培养皿放入内含氧指示剂的厌氧产气袋中，往袋内充混合气体至氧指示剂转变为粉红色，封紧袋口并置于培养箱内缺氧指定时间，缺氧完毕后迅速移出厌氧产气袋并往细胞中换入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，放入培养箱中复氧2h，使心肌细胞遭受缺氧/复氧损伤。在实验中，缺氧时间超过4h时，许多凋亡细胞团漂浮于培养基中，易造成极大误差，因此本实验的时间组别均设置在4h内，缺氧时造成细胞损伤需要同时阻断氧气和糖等能量来源，证实通过厌氧产气袋-缺氧密闭系统建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型稳定、可行且重复性好。
1.1.3低氧/厌氧工作站
储倩雯等[6]采用低氧/厌氧工作站，缺氧时将H9C2细胞置于低氧/厌氧工作站中，分别以完全培养基，无糖培养基和酸性缺氧液培养1、2、4、6、8h，缺氧后换用完全培养基于培养箱中按常规条件培养1h，证实通过本方法并结合酸性缺氧液，能够成功地建立重现性非常好的H9C2细胞H/R模型。
1.2液体石蜡封闭法
液体石蜡封闭法是指缺氧时加入液体石蜡，复氧时吸除即可。曾文静等[7]采用液体石蜡封闭法将体外培养在六孔板中的大鼠心肌细胞H9C2用高温灭菌的液体石蜡2mL封闭，造成缺氧环境，指定缺氧时间结束后吸除石蜡，加入新鲜DMEM培养基，置二氧化碳培养箱中继续培养2h即为复氧，实验中通过检测活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）含量变化及细胞凋亡率，证实通过液体石蜡封闭法建立H9C2缺氧/复氧损伤模型简单易行、重复性好。
1.3安宁包厌氧法
安宁包缺氧体系是采用厌氧菌的培养方法[8]。安宁包缺氧系统由5%二氧化碳安宁包和密闭培养盒组成，安宁包可迅速吸收氧气，1h内将密闭培养罐中的氧气降低至0.1%，并维持5%的二氧化碳环境且不改变培养基的PH值[9]。杨轶，麦丽萍等[10]采用安宁包缺氧体系，将细胞培养基换成无糖无血清培养液，置于安宁包缺氧体系中分别进行缺氧（3h、4h、6h、12h）处理，并将缺氧体系置于37℃细胞培养箱中。缺氧指定时间后，将培养基换成DMEM/F-12培养液，置于21%氧气、5%二氧化碳的37℃的细胞培养箱中进行复氧24h处理，并采用Annexin V/PI双染-流式细胞术检测细胞凋亡率与坏死率，证实采用安宁包缺氧体系处理SD乳鼠原代心肌细胞4h后复氧24h为较合适的缺氧/复氧损伤模型实验条件。
2化学性H/R模型
化学性H/R模型主要包括连二亚硫酸钠（Na2S2O4）耗氧法、氯化钴（COCL2）培养法等。
2.1Na2S2O4耗氧法
Na2S2O4是最常用的氧耗剂[11]。给予适当浓度Na2S2O4加入细胞培养基中，一定时间后可以清除培养基中的氧，造成心肌细胞缺氧[12]。缺氧后移除含有Na2S2O4的培养基并清洗后，加入新鲜的培养基培养一定时间，即造成复氧[13]。刘飞[14]使用Na2S2O4，确定造模的Na2S2O4浓度为4mmol/L，缺氧30min，复氧1h，制备心肌细胞缺氧/复氧模型。
2.2氯化钴培养法
氯化钴（COCL2）作为一种常用的化学性低氧模拟剂，广大研究者可用来模拟细胞缺血/缺氧状态。刘亭[15]利用氯化钴（COCL2）将对数生长期的H9C2细胞吸弃原培养液，加入浓度为800umol/L COCL2作用细胞22小时，使之缺氧，再将其换为完全培养液继续培养2h使之复氧，可建立缺氧复氧损伤心肌细胞模型。
3H/R模型的评价
3.1物理性H/R模型
3.1.1混合气体培养法
混合气体培养法较为常见，且形式多样化，三气培养箱用于建立H/R模型操作简便，但价格昂贵，且每次操作开关箱门后平衡至所需氧浓度的时间长达数小时[9]。厌氧袋、厌氧罐法密闭性能好。厌氧产气袋体积小，缺氧密闭系统对人体无毒无害，且操作过程简单，方法易掌握。此模型重复性好，缺氧时间段较短，易控制，且不影响后期的细胞镜下观察，而其缺点是缺氧密闭系统不能长时间保持厌氧产气袋内的缺氧环境稳定不变，时间一般不宜超过12h[6]。低氧/厌氧工作站可以实现对多参数精确控制，比如氧分压、二氧化碳浓度、温度、湿度、PH值等。其具有操作过程简单，并可降低裸手操作过程中造成的实验误差，但低氧/厌氧工作站是一台贵重仪器，价格昂贵[7]。
3.1.2液体石蜡封闭法
液体石蜡易获得、易灭菌，对人体无毒无害。能最大限度保证操作者的安全，且不会导致溶液性质发生改变，操作过程易行，时间段易控制，方法易掌握。其缺点主要是液体石蜡为脂溶性，难清洗，当荧光显微镜下成像时会有石蜡油滴影响观测视野[8]。
3.1.3安宁包厌氧法
该法操作简单易行，价格低廉，可维持良好的缺氧环境。但缺点在于难以控制气体的浓度，在无测氧仪的情况下无法得知培养盒中的气体浓度是否一直保持稳定，仅能粗略了解氧气浓度情况，同时由于安宁包缺氧时间一般多维持在6h左右，因此不适用于缺氧时间过长的研究[9]。
3.2化学性H/R模型
3.2.1Na2S2O4耗氧法、氯化钴培养法
Na2S2O4或氯化钴作为氧清除剂，在适宜剂量下可迅速清除培养基内的氧气且不损伤细胞膜，但化学试剂性质不稳定，且有毒性。此外，化学试剂的剂量和作用时间也是用该方法成功建模的一大难点[9]。
4结语
心肌细胞缺氧/复氧造模方法主要有物理性及化学性两种，具体建模方法的选择，需综合考虑各方面因素。使用三气培养箱建立H/R模型，操作简便、可靠稳定、重复性好，但价格昂贵。厌氧袋、厌氧罐法操作简单，密闭性能好，且缺氧密闭系统对人体无毒无害，但是缺氧密闭系统不能长时间保持厌氧产气袋内的缺氧环境稳定不变，若对缺氧环境有严格的要求，则不宜采用这种方法造模。低氧/厌氧工作站操作简单，并降低裸手操作中造成的实验误差，但价格昂贵。液体石蜡封闭法中的液体石蜡易获得、易灭菌，对人体无毒无害，操作简单，但液体石蜡为脂溶性，在荧光显微镜下成像时易有石蜡油滴影响视野。安宁包厌氧法操作简单，价格低廉，但缺点在于难以控制气体的浓度。采用Na2S2O4或氯化钴造模，Na2S2O4或氯化钴作为氧清除剂，化学试剂性质不稳定，且有毒性。
综上所述，物理性及化学性H/R模型的造模方法各有利弊，因此，在实验室中综合各种因素选择一种恰当的模型构建方法至关重要。
参考文献
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[3]杜芳,刘伟,刘敏,等.原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的构建[J].宁夏医学杂志,2017,39(07):577-579+576.
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[15]刘亭,吴琼,刘香香,等.荭草花醇提物对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用[J/OL].中药材,2018(01):189-193[2018-02-22].
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