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摘要：目的研究覆盆子对尼古丁戒断后羟自由基代谢的影响，进一步了解尼古丁危害。方法选取健康SD大鼠40只，体重220-250 g，随机分为空白组、模型组、对照组、覆盆子高剂量组、覆盆子低剂量组。除空白组外，其余3组每天皮下注射尼古丁0.4mg/kg/d，共7天，制备尼古丁成瘾模型。最后一次注射尼古丁后24小时，对照组灌胃地西泮，覆盆子高剂量、低剂量组分别灌胃覆盆子提取物200 mg/Kg/d、100mg/Kg/d，连续5d。最后给药1h后，用高架十字迷宫测其焦虑行为，用水杨酸捕获法与HPLC测肝组织中2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）的含量。结果在高架十字迷宫中，与空白对照组相比，尼古丁戒断大鼠在开放臂的逗留次数、时间明显减少（P<0.05）；与模型组相比，对照组能增加其次数、时间（P<0.05），覆盆子高剂量组作用效果更显著(P<0.01)；HPLC检测显示与空白对照组相比，尼古丁戒断大鼠肝组织中2,3-DHBA的含量显著升高（P<0.01），与模型组相比，对照组、覆盆子低剂量组（P<0.05）、覆盆子高剂量组（P<0.01）均可降低肝组织中2,3-DHBA含量，低剂量组降低趋势不明显。结论覆盆子提取物能清除尼古丁戒断时大鼠肝组织中的产生的羟自由基。
关键词：覆盆子；尼古丁戒断；焦虑；羟自由基
本文引用格式：邢宇双,王烨兴,孟娜娜,等.覆盆子对尼古丁戒断大鼠羟自由基代谢的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(86):174-176.
Effect of Raspberry on Hydroxyl Radical Metabolism in Rats with Nicotine Withdrawal
XING Yu-shuang1,WANG Ye-xing1,MENG Na-na1,CONG Zhi-qiang1,LI Lin2
(1Qiqihar Medical University,Qiqihar Heilongjiang;2.Qiqihar City Center for Disease Control and Prevention,Qiqihar Heilongjiang)
ABSTRACT:Objective To study the effects of raspberry on the metabolism of hydroxyl free radicals after nicotine withdrawal,and to further understand the harm of nicotine.Methods Sprague-Dawley rats(220-250g)were treated with 0.4mL/kg of nicotine or saline by daily subcutaneous injection for 7 days.24 hours after the last injection,rats in the contour group were given diazepam,the experimental group were given raspberry(100mg∙kg-1∙d-1、200mg∙kg-1∙d-1),for five days.One hour after the final dose of raspberry,the anxiogenic response was evaluated using an elevated plus maze,determination of 2,3-dihydroxybenzoic acid(2,3-DHBA)in liver tissue by salicylic acid capture and HPLC.Results Rats undergoing nicotine withdrawal exhibited substantial anxiety-like behavior,which was characterized by the decrease in time spent in the open arms of the elevated plus maze,which were greatly attenuated by doses of raspberry.The high performance liquid chromatography analysis revealed that nicotine withdrawal significantly increased determination of 2,3-DHBA in liver.Similar to the results from the elevated plus maze test,the raspberry significantly inhibited the elevation of nicotine.Conclusions Raspberry extract removes hydroxyl free radicals produced in rat liver tissue during nicotine withdrawal.
KEY WORDS:Raspberry;Nicotine withdrawal;Anxiety;Hydroxyl free radical
0引言
尼古丁、阿片类药物的滥用、依赖和成瘾是许多国家和地区日益严重的社会问题，严重危害着社会进步和经济发展。当前，对尼古丁、吗啡等药物成瘾后的戒断治疗是学者们研究的热点问题[1-2]。美国精神病协会认为尼古丁依赖主要是由于个体反复摄取尼古丁所导致的一种慢性易复发的综合症，这是一类神经活性物质滥用所致的疾病[3]。尼古丁依赖满足美国精神疾病诊断标准DSM-Ⅳ中对物质依赖的诊断标准，这一诊断标准包括冲动性使用，停药困难，慢性使用后停药会产生戒断症状[4]。
正常情况下，机体通过一系列的反应不断产生自由基，正常生物体在进化过程中逐渐形成了一个完整的具有抗氧化功能的防御系统[5]。在机体摄入尼古丁后戒断的过程中，自由基和自由基清除系统之间的动态平衡遭到破坏，自由基含量超出正常水平，进而损害机体的组织器官。因此，采用安全有效的方法提高体内自由基的清除水平，有着重要的理论及临床意义。
覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物，具有补肾固精、助阳等功效。大量研究表明覆盆子果实中富含鞣花酸、多糖、花青素、超氧化物、多酚类、黄酮、超氧化物歧酶等[6,7]，具有抗衰老、治疗泌尿道感染、减肥、抗癌防癌、保护心脏、抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病等药理作用[8-14]，但针对覆盆子的抗自由基作用却鲜有报道。本实验研究覆盆子提取物对尼古丁戒断大鼠羟自由基代谢的作用，为覆盆子的功能开发提供依据。
1实验材料
1.1实验动物
健康Sprague-Dawley(SD)大鼠（220-250 g）：由哈尔滨医科大学动物室提供。
1.2实验试剂
覆盆子：购于牡丹江天利医药（经生药学鉴定为蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子的果实）。
尼古丁：购于上海时代生物科技有限公司。
氯化钠注射液（0.9%）：哈尔滨三联药业有限公司。水杨酸：广州市崇骏化工有限公司。
2,3-二羟基苯甲酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。醋酸钠：天津市永大化学试剂有限公司。
柠檬酸：天津市永大化学试剂有限公司。甲醇：天津市永大化学试剂有限公司。高氯酸：哈尔滨试剂化工厂。
1.3实验仪器
高效液相色谱仪LC2103：上海天美科学仪器有限公司Kromasil 100-5C18 250x4.6 mm。
离心机：eppendorf centrifuge 5424。匀浆机：motor cordless749540-0000。
高架十字迷宫：上海欣软信息科技有限公司。
2实验方法
2.1覆盆子提取物的制备
取干燥的中药覆盆子500克磨成细粉，于乙醇中回流提取，过滤，减压蒸发，冻干。提取物根据冻干粉的干重估计，产率为10.6%。
2.2建立尼古丁成瘾模型
选取健康SD大鼠40只，体重220-250 g，随机分为空白组（生理盐水），模型组（0.4mg/kg尼古丁），对照组（0.4 mg/kg尼古丁+地西泮），覆盆子高剂量组（0.4 mg/kg尼古丁+覆盆子提取物200 mg/kg），覆盆子低剂量组（0.4 mg/kg尼古丁+覆盆子提取物100 mg/kg）。除空白组外，其余4组每天皮下注射尼古丁0.4 mg/kg/d，共7天，制备尼古丁成瘾模型。最后一次注射尼古丁后24小时，对照组给予地西泮，覆盆子高、低剂量组分别灌胃覆盆子提取物200 mg/kg/d、100 mg/kg，连续5 d，最后一次给药1h后，用高架十字迷宫测其焦虑行为。
2.3行为学指标测试
实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温24℃，并保持安静。将每只大鼠置于高空十字架（EPM）的正中央（头面向开放臂）释放，大鼠在迷宫中的行为被视频跟踪系统自动记录，每只大鼠测试时间为5 min，实验人员在距离测试箱2 m处观察并记录下大鼠的活动状况。每一只动物完成测试后，清理粪便，并对装置用酒精进行彻底清洁消毒。
测试指标：进入到开放臂次数(OE，open arm entry)：即进入到任一开放臂的次数，以大鼠4个爪均进入到臂内开始，中途有1个爪从该臂中完全撤出，那么该次进入活动完成；进入到开放臂的时间(OT，open arm time)：进入到开放臂停留的时间，单位：秒（s）；进入到闭合臂次数(CE，close arm entry)：即进入到任一闭合臂的次数，以大鼠4个爪均进人到臂内开始；进人到闭合臂时间(CT，close arm time)，进入到闭合臂停留的时间，单位：秒（s）。由以上指标分别计算出：①进入到开放臂和闭合臂的总次数(OE+CE)：表示小鼠的自发活动；②进开放臂次数比例(OE%)=OE/(OE+CE)×100%；③开放臂停留时间比例(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。
2.4肝组织中2,3-二羟基苯甲酸的含量测定
以大鼠体重的0.5%作为水杨酸(60 mg/mL，i.p.)的注射量进行尾静脉注射，60 min后将大鼠断头处死，取出每只鼠同一部位的肝脏组织0.3 g，加入3 mL高氯酸（0.1 mol/L），置于冰水混合物中用匀浆机匀浆1分钟。将上述物质放入离心机中，以10000 rpm离心10 min。取上清液，0.22m滤膜过滤，高效液相色谱系统检测。
色谱条件色谱柱为4.6×250 mm，Kromasi l00-5Cl8，流动相为醋酸钠（30 mmol/L）:柠檬酸（30 mmol/L）:甲醇=2:2:1等度洗脱，流速为l mL/min，室温，波长305 nm，样品中各主要组分用外标法进行定量。
绘制线性回归方程精确称取2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）10 mg，用流动相溶解并定容至50 mL，配成0.2 mg/mL的标准品。以流动相为溶剂配制浓度为0.02、0.04、0.08、0.16、0.2 mg/mL的2,3-DHBA标准溶液，以浓度(c)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并进行线性回归，得出回归方程。
3实验结果
3.1覆盆子提取物对大鼠OE%和OT%的影响
结果显示（表1）：在高架十字迷宫中，与空白对照组相比，尼古丁戒断大鼠在开放臂的逗留次数、时间明显减少（P<0.05）；与模型组相比，对照组能增加其次数、时间（P<0.05），覆盆子高剂量提取物作用效果更显著(P<0.01)。
3.2标准曲线
由上图可以看出2,3-二羟基苯甲酸的线性回归方程为y=264042x+8020（R2=0.9914）
3.3肝组织中2,3-二羟基苯甲酸的含量测定
结果显示（图2）：与空白对照组相比，尼古丁成瘾大鼠肝组织中2,3-DHBA的含量显著升高（P<0.01），与模型组相比，对照组、覆盆子高剂量组可降低肝组织中2,3-DHBA的含量（P<0.05），覆盆子低剂量组作用效果不明显。
4讨论
许多研究表明，在EPM测试中上瘾的物质包括尼古丁和乙醇，在戒断期间可产生严重的焦虑样行为。自发活动的增加就是一个重要的行为学指标，暗示啮齿类动物的焦虑样行为[15]。本实验结果表明，尼古丁戒断大鼠可表现出焦虑行为，其在开放臂停留的时间与空白组相比较短，进入开放臂次数也相对减少。目前，药物治疗是抗焦虑的最直接治疗方法[16]，然而，众所周知的苯二氮类药物具有很大的局限，近来中草药在治疗焦虑症状变得更受欢迎了。在目前的研究中，200 mg/Kg的覆盆子提取物可明显改善尼古丁戒断期间大鼠的焦虑行为，而低剂覆盆子提取物作用效果不太明显，说明覆盆子提取物对焦虑样行为的作用效果可能存在剂量依赖性。
机体在正常情况下存在由酶和非酶物质所组成的完整的抗氧化系统，它与体内所产生的活性氧保持动态平衡，避免机体组织受到损伤。自由基是指含有未配对电子的原子、分子或原子团，它是伴随着机体的正常生理代谢而产生的一类对机体有害的活性物质。许多科学家已经证实某些自由基可导致癌变。当机体摄入一定量尼古丁后会引起体内细胞的损伤，进而产生过多的自由基，在各种氧自由基中，由于羟自由基是仅次于F-的强氧化剂，所以它的活性最强，对机体伤害最大。生物体的内环境比较复杂，·OH在生物体内寿命较短且含量低，很难对其进行直接检测。本实验，我们采用水杨酸对·OH进行捕获，生成在体内稳定且不经由内源性途径产生的羟化衍生物--二羟基苯甲酸。由于2,5-DHBA不仅可通过·OH攻击而形成，还可由肝组织中的P450酶催化水杨酸而成，所以本实验我们选取具有特异性的2,3-DHBA的生成量进行检测。由实验结果我们观察到，动物摄入尼古丁形成戒断症状后，体内2,3-DHBA的含量明显升高，高剂量覆盆子提取物可显著降低其含量，低剂量覆盆子提取物的作用效果不明显，说明覆盆子具有一定的抗氧化作用。
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