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摘要：目的探讨滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层软骨诱导化复合体（SMSCs-SIS）修复兔膝关节半月板损伤的潜能及可行性。方法选取58只健康体质新西兰大白兔为研究对象，作膝关节半月板损伤造模后将其随机分为实验组（n=29）和对照组（n=29）；实验组同时于半月板损伤处植入软骨诱导化SMSCs-SIS复合体；对照组仅植入小肠黏膜下层支架。后分别单笼饲养，两组大白兔均于术后第4周处死并取材，采用大体形态学观察、生物力学及阿尔新蓝比色法检测糖胺多糖（GAG）含量作为评估指标评价半月板损伤修复情况。结果大体及形态学观察结果显示实验组所有半月板裂口均愈合良好；对照组半月板损伤处裂口较前稍增宽，仅见少许再生组织填充，裂口周围组织萎缩。生物力学结果显示实验组半月板组织弹性模量为（42.71±2.02）Mpa，对照组为（10.01±1.52）Mpa，两组间损伤修复半月板组织弹性模量差异比较有统计学意义（P<0.05）。阿尔新蓝比色法GAG含量测定结果显示实验组为（4.14±1.02）ug/mL，对照组为（1.31±1.02）ug/mL，两组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层软骨诱导化复合体材料（SMSCs-SIS）移植可有效促进兔膝半月板局部损伤的修复，是修复兔膝半月板损伤的有效方法之一。
关键词：半月板损伤；滑膜间充质干细胞；小肠黏膜下层
本文引用格式：杨业静,李兴艳,李林,等.滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层复合体修复兔膝半月板损伤研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(63):232-233.
0引言
众所周知，半月板是位于膝关节形似月牙形的纤维软骨，其功能在于稳定膝关节，减缓膝关节承载负荷，增加关节囊内滑液的接触。从血供上讲，半月板由内致外平均分为白区、红白区和红区三个区域，红区血管覆盖丰富，血供从外至内依次减弱，白区无血供覆盖。同时，膝关节半月板损伤是一种常见的膝关节运动型损伤，目前对半月板损伤处理的方式较多为半月板的切除修复及缝合，对于血供区域的损伤常规予以缝合，而对于白区的损伤常规予以切除修复处理[1]；但对于半月板损伤区域的定位成为临床治疗半月板的难题。随着干细胞再生及组织工程的兴起，临床上应用干细胞再生联合组织工程移植治疗半月板损伤取得了快速的进展，出现了一系列干细胞分化再生及材料组织工程移植的应用[2]。
本实验以猪小肠黏膜下层（SIS）为支架载体材料，将异体兔滑膜间充质干细胞（SMSCs）为种子细胞种植在载体材料上，用含软骨源性形态发生蛋白-2（CDMP-2）和转化生长因子β1（TGF-β1）的软骨培养基培养2周形成滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层（SMSCs-SIS）复合材料后植入半月板损伤区。随后对所有新西兰大白兔进行单独饲养，于第4周处死兔并取材，采用大体形态学观察、生物力学及阿尔新蓝比色法检测糖胺多糖（GAG）含量作为评估指标了解半月板损伤修复情况（方法参考文献[3]）；探讨SMSCs-SIS复合材料修复兔半月板损伤的潜能及可行性，为临床治疗半月板损伤提供参考依据及可行性方案。
1材料与方法
1.1材料实验复合材料的构建
选取猪空肠脱细胞的SIS作为支架材料(从市场购买新鲜猪空肠，分离提取方法见文献[4])，将异体SMSCs（新西兰大白兔由广西医科大学动物实验室提供，分离提取方法见文献[5-6]）作为种子细胞种植在载体材料上，随后用含CDMP-2和TGF-β1的软骨培养基诱导软骨化培养2周，构建SMSCs-SIS复合材料。研究对象实验动物的获取：选取广西医科大学动物实验室提供的58只新西兰大白兔的实验动物为研究对象，体重约为2.1-2.6kg，其中雄性30只，雌性28只。两组实验动物间体重及雌雄性别差异的一般资料比较无统计学意义（P>0.05）。
1.2方法
选取58只健康体质新西兰大白兔为研究动物对象，将兔固定于手术台面上，于耳缘静脉行静脉全身麻醉（麻醉药物为2%戊巴比妥钠，量约2mg/Kg），予大白兔膝关节常规消毒、铺巾后，取双膝关节内侧弧形切口为手术入路，沿髌骨内上缘至胫骨结节内侧作一长约0.8cm皮肤切口，谨慎操作，依次分层切开皮肤、皮下组织、筋膜，防止损伤膝关节表面软骨。随后完整的显露内侧半月板前后角、体部及股骨髁软骨面，挑起半月板，予镰状刀片于内侧半月板前角和体部中央略靠近半月中心作一长宽分别约0.4cm、0.2cm大小的全层半月板损伤模型。操作时动作轻柔，防止损伤半月板下的软骨。随后将大白兔随机分为实验组和对照组，每组29只。实验组将SMSCs-SIS复合材料多层折叠、修剪整齐与缺损同等大小后移植至半月板裂口损伤处，然后用5-0的可吸收缝线缝合固定。对照组同上方法做半月板损伤模型，仅做SIS支架材料移植缝合。对两组大白兔膝关节囊、皮下组织、皮肤切口仔细缝合，所有大白兔单笼独自饲养，术后膝关节不制动。饲养4周后采用过量麻醉法处死大白兔，打开兔膝关节囊后做大体形态学观察；然后取大小约5mm的再生组织作为研究标本（如图1、图2），使用生物力学实验机进行生物力学测试（20mm/min的加载速度，连续加载5次，使用的最大垂直压力为450N），随后计算标本的弹性模量；最后取剩下的标本做阿利辛蓝比色法检测糖胺多糖（GAG）含量作为评估指标了解半月板损伤修复情况。
1.3观察指标
①所有大白兔切取半月板，对其进行大体形态学观察，注意观察裂口损伤处是否有再生组织，再生组织与原本半月板组织的差别及裂口周围组织的再生情况。同时也注意再生组织的颜色、质地，以及相对应的周围韧带及软骨的变化。②切取修复再生组织标本作弹性模量测定及阿尔新蓝比色法检测糖胺多糖（GAG）含量，注意观察两组实验的颜色变化。
1.4统计学方法
所有数据应用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，数据以(均数±标准差)表示，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验进行统计学差异分析，检验水准α=0.05，以P<0.05表示有统计学意义。
2结果
对照组有1只兔在术后第3周死亡，其他动物兔存活良好。实验组中有1只兔发生膝关节伤口感染，因此，放弃此兔半月板的研究，其他兔膝关节活动可，皮肤伤口愈合佳。大体形态学观察结果显示实验组所有半月板裂口均愈合良好，裂口损伤处被完整的再生组织填充，边缘修复痕迹模糊，但痕迹两侧正常半月板组织与裂口再生组织仍存在着明显的外形差异；对照组半月板损伤处裂口较前增宽，无再生组织填充，裂口周围组织萎缩。生物力学测试结果显示正常半月板弹性模量为（101.79±0.72）Mpa，实验组再生组织半月板弹性模量为（42.71±2.02）Mpa，约为正常半月板组织弹性模量的40%，对照组再生组织半月板弹性模量为（10.01±1.52）Mpa，实验组明显大于对照组；两组间弹性模量差异比较有统计学意义（P<0.05）。阿尔新蓝比色法测定GAG含量结果显示正常半月板为（11.51±0.39）ug/mL，实验组再生组织半月板GAG含量为（4.14±1.02）ug/mL，对照组再生组织半月板GAG含量为（1.31±1.02）ug/mL，实验组明显大于对照组；两组之间半月板GAG含量差异比较有统计学意义（P<0.05）。数据如表1。
3讨论
半月板是组成膝关节的重要组成部分，具有沉重及减缓体重压力的作用。我们的研究结果显示滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层复合体移植可有效促进兔膝半月板损伤的修复。因此，本文将从半月板解剖、组织及细胞学基础对半月板损伤修复研究作以下简要分析。
在半月板解剖层次研究上，半月板在解剖上从外至内可平均分为三个等份，分别称作外侧的红区、红白交界区和内侧的白区，其血管组织及血运情况依次减弱。对于外侧的损伤，学者们常常主张予以简单修剪及缝合，而对于内侧的损伤，因其血运较差，常规不予以缝合，一般主张以损伤处切除从而减轻患者的疼痛及缓解半月板的进一步损伤[7-8]。但在临床上，较多的出现的问题为临床医生对半月板损伤处定位困难，因此尽管临床医生通过关节镜明确半月板损伤，在治疗上仍难以明确具体的处理措施，切除或缝合与否这两种治疗方式的选择成为修复半月板的一大难题[9]。而本研究为避免这一难题，直接从细胞和组织层面出发，利用滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层复合体直接修复损伤半月板。结果显示其疗效可，具有研究的可行性。
此外，在半月板组织生化成份组成研究上，其组织由细胞和细胞外基质两部分组成。前者主要包括软骨细胞、干细胞等；细胞外基质主要包括有机质和无机质两大类。有研究指出，半月板有机物质组成中占量比例最大的为胶原组织（约75%），其他还包括蛋白聚糖（约17%）、DNA（约2%）、粘连蛋白和弹性蛋白（约占2%）等[10]；胶原组织有多种类型，其中，半月板外侧红区胶原主要是I型胶原组成，含量约为80%，内侧白区胶原组成中，Ⅰ胶原约占40%，而II型胶原约占60%[11]。因此，对于半月板损伤的修复研究，主要是指半月板细胞和细胞外基质组织的再生修复研究，如软骨细胞和细胞外胶原组织的再生等；主要体现在治疗、护理方式优化上[12]。我们的研究结果生物力学测定修复半月板组织弹性模量表明，滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层复合体移植至半月板损伤处可在一定程度上恢复损伤半月板组织的弹性模量，这可能与半月板组织成份中的胶原组织含量有关，有待下一步实验的深入研究。
同时，随着生物材料组织工程技术的飞速发展，应用干细胞联合组织工程移植方法构建半月板组织模型为解决半月板组织损伤修复提供了一条新的治疗方式和途径[13]。如有学者将Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶复合材料植入兔半月板损伤处，分别于术后2周、4周、8周通过形态学及组织病理学观察损伤半月板的修复情况，通过实验组和对照组比较发现植入了Ⅰ型胶原-TGF-β1-纤维蛋白胶复合材料的半月板修复情况无论在形态上还是病理组织学上都明显优于空白对照组[14]。此外，有学者通过在聚乳酸聚乙酸共聚物(PLGA)支架的基础上联合成肌细胞诱导软骨定向诱导后形成的复合材料，随后将其植入比格犬半月板组织损伤处，并随机分为实验组和对照组，于术后4、8、12周通过生物化学及生物力学的方法观察半月板修复情况。结果发现实验组聚乳酸聚乙酸共聚物支架材料随着观察日期逐渐降解从而吸收；通过组织学发现实验组成肌细胞可逐渐合成分泌新生胶原组织，并最终形成半月板样纤维组织，而对照组组缺损区则无半月板样显微组织的再生，裂口处仅为少许纤维组织样的修复组织填充[15]。本实验研究结果与之一致，本实验将软骨诱导化的复合组织材料缝合至半月板损伤处的疗效明显优于空白对照组。
而在干细胞联合支架材料培养研究中，干细胞具有多向分化的潜能，具有良好的应用前景；生物活性支架材料是构建组织和器官最基本的载体，具有良好的组织相容性[16]。但组织干细胞来源是半月板组织移植工程亟待解决的问题[17]。目前国内外用于半月板干细胞组织移植工程的种子细胞来源有脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞、滑膜间充质干细胞、半月板纤维软骨细胞和骨髓间充质干细胞等等。本研究通过以小肠黏膜下层为支架载体材料，联合异体滑膜间充质干细胞定向软骨细胞分化培养后形成SMSCs-SIS复合材料，后将其植入半月板损伤区。探讨其修复兔半月板损伤的潜能及可行性，为临床治疗半月板损伤提供参考方案；后结果发现实验组半月板的修复效果明显优于对照组。因此，我们的结果验证了滑膜间充质干细胞软骨诱导分化同样能有效修复损伤半月板。
综上所述，小肠黏膜下层作为支架，予异体滑膜间充质干细胞作为种子细胞种植于支架上，同时将软骨定向分化培养后的SMSCs-SIS复合材料植入新西兰大白兔半月板损伤区域修复兔半月板损伤是一种修复半月板损伤的可靠方法之一。但是由于时间及观察指标的限制，本实验仅对植入术后4周的半月板进行了大体形态学及再生组织标本的观察，尚需更长期的实验研究来进一步验证实验的结果，并且下一步的工作将是增大样本量和研究时间从而可以进行各种指标的系统检测并进行长时间的统计学分析，为半月板软骨工程化修复和再造的临床应用提供更有力的实验证据。
4结论
滑膜间充质干细胞-小肠黏膜下层软骨诱导化复合体材料（SMSCs-SIS）移植可有效促进兔膝半月板局部损伤的修复，是修复兔膝半月板损伤的有效方法之一。
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