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摘要：目的通过对红豆、鲫鱼、虾头等天然原材料提取乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，acHe），确定最佳提取工艺条件。方法提取到的游离酶对反应条件要求高，易失活，不利于用于工业化生产当中，采用溶胶-凝胶（sol-gel）包埋技术将酶固定在复合凝胶载体上，有利于酶的稳定性和保存性。通过检测对从不同原材料中提取出来的乙酰胆碱酯酶酶活力，研究固定酶对氧乐果、马拉硫磷等有机磷农药检测的灵敏度。结果红豆中提取的胆碱酯酶相对于鲫鱼和虾头中提取的胆碱酯酶在固定后酶活性更好，在37℃温度下、酶剂量在50μl、pH值为7.3，酶与待测液反应15 min为最佳反应条件。且红豆中提取的酶在sol-gel包埋法固定下，酶的固定效率高达90%以上，回收率也高达85%。结论sol-gel包埋法固定乙酰胆碱酯酶有利于酶的活性提高，且可重复利用。
关键词：乙酰胆碱酯酶；酶活性；sol-gel包埋法；有机磷农药
本文引用格式：王鼎文，杨凯，樊秀花，等.sol-gel包埋法固定乙酰胆碱酯酶对蜂蜜中马拉硫磷的快检研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(85):7-9.
Rapid Detection of Organic Phosphorus in Fruits and Vegetables by Sol-gel Immobilization of Acetylcholinesterase
WANG Ding-wen,YANG Kai,FAN Xiu-hua,ZHANG Ai-lin△
（Tianjin Agricultural University College,College of Food Science and Biotechnology，Tianjin）
ABSTRACT:Objective Acetylcholinesterase(ACHE)was extracted from natural raw materials of red beans,crucian carp and shrimp,and the optimum extraction conditions were determined.Methods Extract the free enzyme reaction conditions demand is high,easy deactivation,unfavorable to used in industrial production,the sol-gel(sol-gel)crosslinking technology will enzyme on the composite gel carrier,is conducive to the stability of the enzyme and save.The sensitivity of acetylcholinesterase activity and acetylcho-linesterase to the organophosphorus pesticides,such as oxylepate and malathion,was detected by detecting the activity of acetylcholin-esterase from different raw materials.Results The experimental study of cholinesterase extracted from red bean relative to the carp and shrimp head cholinesterase extracted,at 37℃temperature,enzyme dosage in 50μl,pH value of 7.3,enzyme and fluid under test 15 min is the best reaction conditions.In addition,the enzyme extracted from red beans was immobilized on the sol-gel embedded acetylcholin-esterase,the enzyme immobilization efficiency was as high as 90%,the recovery rate was as high as 85%.Conclusion The immobiliza-tion of acetylcholinesterase by sol-gel embedding method is beneficial to increase the activity of acetylcholinesterase and can be reused.KEY WORDS:Acetylcholinesterase;Enzyme activity;Sensitivity;Organophosphoru
0引言
农产品生产过程中同一块土地多年复种同一种农作物，造成病虫害增多，抗药性增强，农药剂量不断增加，农药的滥用给人们食品和生态环境方面带来了担忧[1]。国内还有地区使用残留时间较长的有机磷农药，对人体神经系统、胃部、肝脏、器官损伤严重，甚至引发癌症危害人体健康。农残问题已经非常严峻，也引起了人们的高度关注[2]。酶抑制检测法相对于其他方法来说具有较为明显的优势，也符合人们检测现场快速检测的需求[3]。利用有机磷对乙酰胆碱酯酶有强抑制性原理进行农残留的检测。胆碱酯酶将乙酰胆碱水解硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱与双硝基苯甲酸发生显色反应。通过吸光度的变化值则可计算出酶的抑制率，从而推算出农药的残留量[4]。本实验分别从红豆、虾头、鲫鱼鱼肉以及鱼脑等实验材料中提取胆碱酯酶；再对其中的酶进行提取纯化的研究，通过实验确定提取过程的最佳工艺参数，采取硫酸铵盐析法和透析法确定合适的纯化工艺。利用溶胶-凝胶（sol-gel）包埋法固定胆碱酯酶，减少了酶的自溶现象，酶与反应产物易分离，在酶的储存及重复利用上具有明显优势。
1材料与方法
1.1实验材料
红豆南，南美白对虾，鲫鱼均购于天津市红旗农贸市场；二硫代二硝基苯甲酸：美国sigma公司；碘化硫代乙酰胆碱：北京百奥莱博科技有限公司；四甲氧基硅烷：北京寰宇科创生物科技发展有限公司；HT2134透析袋：优博生物有限公司；马拉硫磷：天津京津农药厂；其他试剂均为实验室常规试剂。
1.2实验仪器及设备
低速离心机（LD5-2B）：北京雷勃尔离心机有限公司；磁力搅拌器（S21-2）：上海司乐仪器厂涡旋震荡仪（Vortex-Genie 2）：上海纳兹仪器有限公司
1.3实验试剂的配制
凝胶载体的制备：
A溶液：在离心管中将1.7ml的TMOS、100μl的甲醇、300μl的50%（v/v）甘油水溶液、250μl的双蒸水和100μl HCl(0.04mol/L）混合均匀后，在涡旋震荡仪上震荡20min,期间不时置于冰水浴中冷却。
B溶液：取0.2g的壳聚糖粉末溶解在4ml质量分数为1%的乙酸中形成粘稠淡黄色溶液。
A、B溶液在离心管中轻轻震荡快速混合均匀。取12支洁净的试管编成四组，每支试管中加入3mlPBS缓冲溶液，酶液100μl，壳聚糖质膜1000mg粉末混合在4℃条件下交联24h，将载体置于4℃0.02mol的PBS溶液中保存。将冲洗和剩余溶液取出测量吸光光度值计算出剩余酶的酶比活力值，从而得出sol-gel凝胶包埋法固定胆碱酯酶的效率。
酶的固定效率=1-（剩余酶活/总酶活）×100%
1.4实验方法
1.4.1粗酶液的提取
将红豆挑选好后粉碎，PBS（pH7.3）溶液以（质量体积比）1：4混合后，在磁力搅拌器上冰浴搅拌30min制成匀浆。离心（4000r/min)10min，取上清液即为粗酶液提取液，4℃条件下冷藏备用。
鲫鱼取出鱼脑去除凝血和非脑组织，PBS溶液(pH=7.3)以质量体积比1:4混合研磨成匀浆后，在磁力搅拌器冰浴搅拌30min充分混匀。离心（6000r/min）10min,取上清液即为粗酶液，4℃条件下冷藏备用。
鲜活南美对虾将脑组织称重。PBS溶液(pH=7.3)以质量体积比1:4混合研磨成匀浆后，在磁力搅拌器冰浴搅拌30min充分混匀。离心（6000r/min）10min,取上清液即为粗酶液，4℃条件下冷藏备用。
1.4.2胆碱酯酶的提纯
量取50ml粗酶液加入硫酸铵至体积分数为30%饱和度，4℃条件下静置8h，在4000r/min条件下离心20min弃去沉淀，静置30min后于4℃条件下6000r/min离心10min,收集上清液。然后再添加硫酸铵配成体积分数为50%溶液保存在4℃条件下静置8h，在6000r/min离心10min，离心取上清液加入到透析袋中进行透析处理。
1.4.3蛋白质含量的测定
参照考马斯亮蓝G-250法[5]。
1.4.4酶活的测定
采用Ellman方法[6]，并稍加以改进。
1.4.5sol-gel包埋法固定胆碱酯酶
包埋法将游离在PBS溶液的酶与单体混匀，通过一些其他引发剂或者改变环境因素使得酶与单体物质发生聚合反应，在这么一个过程中让酶进入到材料的孔隙中，然后利用硅烷化反应调小孔隙口的大小，将酶固定在材料的孔洞中的方法。
2结果与分析
2.1标准蛋白质含量标准曲线
采用牛血清白蛋白，通过考马斯亮蓝法测定牛血清白蛋白中蛋白质含量标准曲线如图1所示。
由图1可知，线性回归方程为：y=0.9919x+0.0046，R2=0.9997，再将OD值带入方程求出x值为样品浓度，由此推算出牛血清白蛋白含量为0.997。
2.2不同酶源的比酶活力的比较见图2。
由图2可以清晰看出不同来源的胆碱酯酶酶比活力的比较，虾头>鲫鱼脑>鲫鱼>红豆，虾的酶活力可达到0.274A/mg，红豆的酶活力0.238A/mg。红豆廉价易得且在干种子时期酯酶活性高，选择红豆作为胆碱酯酶提取原材料。
2.3提取液种类的确定
采用蒸馏水，PBS溶液，0.9%的NaCl溶液提取胆碱酯酶，确定较佳的提取剂。从图3可以得出，提取胆碱酯酶所选择的三种提取液中（pH=7），以虾头为例在蒸馏水为提取液时吸光度值为0.173，0.9%，NaCl溶液为0.205，PBS溶液为0.232。所以PBS溶液浸提效果明显为相对较佳提取液，提取效果明显高区其余两种提取液。
2.4sol-gel包埋法对酯酶固定及酶的回收
凝胶载体制备时，将悬浮在磷酸缓冲溶液中的胆碱酯酶与其混合使二者发生包埋反应。在此过程酶进入介质孔道中，此过程中利用硅烷化反应调节孔径大小，从而将酶分子固定在介孔材料中。王金梅等人利用海藻酸钠制成的球形颗粒为载体，包埋法固定化了电鳗乙酰胆碱酯酶。夏文水等人利用壳聚糖作为固定化酶载体固定酶。见表1。
2.5马拉硫磷对红豆乙酰胆碱酯酶的抑制影响
取75%的氧乐果1.334μl配制成50ml溶液，取10ml将其均匀喷洒在摘下的100g蔬菜页面上10min后，随机取1g叶片用2mlPBS缓冲溶液进行洗涤，取洗涤液与固定化胆碱酯酶混匀在37℃下水浴20min连续测其OD值3min，做多组平行实验，测定马拉硫磷OD值，再通过公式计算出抑制率。最大残留限量标准值为0.5mg/Kg马拉硫磷在蜂蜜中的检出标准值为1mg/Kg[7]。见表2。抑制率=1-[（对照酶活力A412变化值-处理酶活力A412变化值）/对照酶活力A412变化值]×100%由表1和表2可知有不同胆碱酯酶对机磷农药都具有较强的敏感性，能够迅速检测出农药的含量，对于农产品农残检测具有较好的效果，根据国标能够检测不同农产品农残限量[8，9]。固定的胆碱酯酶在与待测溶液反应后可取出，用PBS溶液洗涤多次，在与标准化硫代乙酰胆碱反应测定酶的回收率，根据实验证明酶回收率在85%以上。说明固定化酶具有酶活稳定且具有很好的重复利用率[10]。
3结论
通过比酶活力的高低及酶原的广泛易得选取红豆为胆碱酯酶酶原，最终采用pH值为7.3的PBS溶液作为浸提液。采用sol-gel包埋法对胆碱酯酶进行固定，酯酶提取后保存较长时间相对困难，酯酶容易失去活性尤其是植物酯酶[11]，为了使胆碱酯酶能更好的保存将其利用sol-gel包埋法固定在载体上，凝胶中有一定水分这样有利于酶的活性。此外酶固定效率高达90%左右，酶的回收率也有85%以上，该包埋法作用下固定酯酶能重复利用[12]。
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