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摘要：目的探讨电针心经穴对脑缺血损伤的干预效应及神经保护、血管新生的作用。方法将SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心经组、肺经组，每组10只。采用颈外动脉插入线栓法复制局灶性脑缺血模型。心经组取“灵道”“极泉”“少海”“神门”穴，肺经组取“天府”“尺泽”“列缺”“太渊”穴，于造模后6、24、48、72h进行电针治疗，每次30min。用TTC染色法检测脑梗死体积，用酶联免疫吸附法检测血清中神经生长抑制因子（Nogo-A）的含量，免疫组化法检测脑梗死区Nogo-A的表达水平。结果与正常组、假手术比较，模型组血清Nogo-A含量增多（P<0.01），心经组、肺经组少于模型组（P<0.01），心经组降低血清Nogo-A含量作用优于肺经组（P<0.01）；Nogo-A在脑梗死区的表达各组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论电针可降低血清、脑组织中Nogo-A的含量，且心经组作用优于肺经组，对脑缺血后神经修复具有一定促进作用。
关键词：MCAO大鼠；电针；心经穴
本文引用格式：马纹蕊,武娟,洒玉萍,等.电针手厥阴心包经穴对MCAO大鼠血清、脑组织中NGF和Nogo-A的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(80):221-223.
0引言
脑梗死是由于动脉狭窄或完全闭塞，导致脑组织缺氧、缺血、坏死，从而引起的一种脑血管疾病。根据临床报告显示，目前脑缺血疾病的治疗普遍应用针灸，研究发现针灸可以干预脑缺导致血发病相关的多种危险因素[1-2]，对患者语言、运动、神志等功能的提高和预防并改善并发症都有显著的促进作用[3-5]。大量文献记载[6-7]电针“内关”和“神门”对脑缺血损伤后心脑组织细胞凋亡与炎性损伤有抵抗作用，电针“内关”、“曲泽”有促进脑缺血血管新生的作用。此次实验拟以大鼠局灶性脑缺血模型（MCAO）为观察对象，观察电针心经穴对大鼠神经功能缺损、脑梗死体积、微血管密度以及对大鼠血清和脑组织中Nogo-A表达的影响。探索电针心经穴对脑缺血损伤的干预效应及神经保护、血管新生的作用，为心经穴治疗脑血管病及从心治脑的研究提供实验依据。
1材料与方法
1.1动物与分组
SPF级健康成年雄性SD大鼠50只，体重220~250g。其饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按照SPF级实验动物的要求进行制备和消毒，造模前禁食1d。
动物分组采用先造模后分组的方式，将大鼠随机分为5组，每组6只。正常组：不作处理；模型组：MCAO模型对照组；假手术组：大鼠切开颈部皮肤，分离CCA及ICA至PPA，不插栓线；手少阴心经穴组：造模＋电针心经穴；手太阴肺经穴组：造模＋电针肺经穴。
1.2主要试剂与仪器
主要试剂：Nogo-A酶联免疫(ELISA)试剂盒；Nogo-A兔抗鼠抗体；SABC免疫组化染色试剂盒；
主要仪器：SDZ-II华佗电针治疗仪、华佗牌0.30mm×15mm毫针；全自动酶标洗板机；酶标仪；电热恒温干燥箱；石蜡切片机;双目显微镜；显微摄像系统；高清晰度彩色病理图文分析系统。
1.3造模方法
采用大鼠大脑中动脉持久性局灶性缺血模型。参照Zea Longa和Koizumi[8-9]报道的方法，即用颈外动脉插入线栓法建立MCAO脑缺血模型。造模完成后对各组大鼠采用Zea Longa 5级4分制评分：无神经功能缺损计0分；梗死对侧前爪内收、伸直障碍计1分；向偏瘫侧转圈者计2分；行走时向偏瘫侧倾倒计3分；意识丧失、不能行走计4分。选取评分为1-3分的大鼠纳入观察。假手术组仅暴露颈部正中切口，不做其他处理。
1.4针刺方法
根据《实验针灸学》[10]动物穴位图谱及拟人比照法定位：按照经脉“从胸走手”的循行方向，依次选取瘫痪侧肢体不同节段的常用穴位，作为心经、肺经的代表穴。手少阴心经选取神门、灵道、少海、极泉；手太阴肺经选取太渊、列缺、尺泽、天府。
于造模后6、24、48、72h时进行治疗，针刺瘫痪侧上肢，以15mm、36号毫针刺入穴位，针刺深度3-4mm，接SDZ-Ⅱ型电针治疗仪。“神门”“灵道”一组，“少海”“极泉”一组，“太渊”“列缺”一组，“尺泽”“天府”一组，正极接近心端穴位，负极接远心端穴位，采用连续波，频率为20Hz，输出电压2-4V，输出电流4-6mA以局部组织轻颤为度，时间30min。
1.5观察指标及检测方法
大鼠血清Nogo-A含量的检测：治疗结束后，所有大鼠用10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉，腹主动脉插管取血4-5mL，静置30min后离心(3000r/min,15min)，用移液枪抽取上清液，严格按照试剂盒的操作说明，应用ELISA法检测血清Nogo-A的浓度。以标准物的浓度为横坐标，吸光度(OD)值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
Nogo-A在脑梗死区的阳性表达：处死大鼠，断头取脑，切取病灶侧脑组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、透蜡、包埋、切片，切片厚度4um，选取相邻的切片分别应用免疫组织化学法检测梗死区脑组织的Nogo-A表达量。具体步骤：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，采用高压修复，当高压锅慢慢喷气时，计时2min，自然冷却，蒸馏水水洗，PBS洗5min×3次，3%H2O2室温20min，PBS洗2min×3次，滴加一抗兔抗鼠（1:100），4℃过夜，PBS洗2min×3次，滴加二步法二抗通用工作液，室温30min，PBS洗3min×3次，DAB显色，苏木精复染，脱水透明，分片。免疫组化后，Nogo-A在脑细胞胞质及突起内标记为棕黄色的颗粒。应用高清晰度彩色病理图文分析系统，每只大鼠取5张切片，每张切片选取患侧脑组织海马区C1、C2、C3周边选择3个高倍（×400）视野进行NGF和Nogo-A阳性表达吸光度值测定。
1.6统计学方法
计量资料采用均数加减标准差（±s）表示。所有资料进行正态性检验。符合正态分布者，多组计量资料采用单因素方差分析，方差齐者用LSD法和SNK法，方差不齐者用Tambane’s T2或Dunnett’s T3法。不符合正态分布者，采用多个独立样本比较的秩和检验。所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠神经功能缺损评分的比较
由表1可知，（1）正常组、假手术组无神经功能缺损，说明假手术过程未引起神经功能缺损症状的出现；（2）造模后2h时（治疗前），模型组、心经穴组、肺经穴组神经功能缺损评分明显高于正常组及假手术组（P<0.01），且各造模组评分比较无统计学差异（P>0.05）,说明模型成功复制，治疗前组间具有可比性；（3）组内比较：与2h比，心经组在24h、48h、72h神经功能缺损评分明显降低，差异有统计学意义，心经组神经功能缺损评分明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；而模型组、肺经组各时相点神经功能缺损评分差异无统计学意义（P>0.05）;（4）组间比较：与模型组各时相点比，心经组在48h、72h神经功能缺损评分有不同程度的下降（P<0.01，P<0.05），肺经组评分无统计学差异（P>0.05）；与肺经组各时相点比，心经组评分无统计学差异。提示电针心经穴组可较好的改善大鼠神经功能缺损的症状，肺经穴组未见明显的改善。
2.2各组大鼠脑梗死体积的比较
由表2可知，（1）各组大鼠全脑体积比较无差异（P>0.05），但模型组、肺经穴组数值上相对偏大，可能与脑缺血后脑组织水胖有关系；（2）正常组、假手术组大鼠无脑梗死杜，说明手术本身不会引起脑缺血改变；（3）与正常组和假手术组比较，模型组、心经肺经穴组脑梗死体积、梗死率明显增大（P<0.01）提示造模成功。（4）与模型组比较，心经穴组脑梗死体积、梗死率明显减小（P<0.05），肺经穴组梗死率减小（P<0.05）但脑梗死体积无统计学差异，说明电针干预可以激活大鼠体内某种调控机制，对减小脑梗死率和（或）梗死体积有一定的促进作用。（5）与肺经组比较，心经穴组梗死体积和脑梗死率差异均无统计学意义（P>0.05），提示三组作用相当，电针干预调节暂未能体现出经脉的特异性。
2.3各组大鼠血清中Nogo-A表达的比较
由图一可知：空白组和假手术组Nogo-A的表达随时间推移无明显变化,模型组和假手术组组Nogo-A的表达开始升高至达到高峰,然后明显下降,但仍稍高于空白组。电针组各时间点Nogo-A的表达均低于模型组和假手术组,后两组Nogo-A表达水平无明显差异。
2.4各组大鼠脑梗死区中Nogo-A表达的比较
由图1可知：与正常组、假手术组比，模型组脑梗死区NGF阳性表达量均升高（P<0.01）；与模型组比，心包经组、肺经组脑梗死区NGF含量升高（P<0.01）；与肺经组比，心包经组脑梗死区NGF阳性表达升高（P<0.01），说明电针对脑梗死NGF阳性表达的干预调节具有经脉的特异性，心包经组作用优于于肺经组。Nogo-A在各组组间比较差异均无统计学意义（P>0.05），说明假手术过程、造模过程及电针干预对脑梗死区Nogo-A的表达无明显调节作用，可能与样本量小或（和）Nogo-A在脑缺血急性期脑组织中的变化趋势不稳定有关。
3讨论
脑缺血后患者的康复主要取决于中枢神经系统修复，基于脑血管新生为结构基础的前提下[11-12]，多种神经功能因子之间的相互作用决定神经功能修复的好与坏。多种神经功能因子中NGF作为一种重要因子调节神经细胞生长，对神经元的生长、发育、分化及再生和功能性表达都具有重要的调控作用；其次Nogo-A作为Nogo蛋白家族中一种，在CNS损伤后抑制轴突再生的能力最为强烈[13]。
大量文献研究显示[14-18]，针刺“内关”“足三里”“水沟”“百会”等穴，均可有效的增加内源性神经生长因子的表达，从而改善大鼠脑缺血后突触超微结构，促进神经修复，改善肢体功能，达到抗脑缺血损伤的作用。同时研究[19-20]还显示：电针治疗可下调脑梗塞区神经生长抑制因子Nogo-A的表达，诱导神经轴突再生，减轻脑梗死后的神经损害。
《内经》中记载心主血脉，心主血脉是人体神志活动的物质基础，如《素问痿论》：“心主身之血脉”，《素问六节》：“诸血者皆属于心”，故二者的关系是功能活动和物质基础的关系。
根据中医理论，心具有主血脉的生理功能，而血液对人体四肢百骸、诸官弯均有霜养作用，脑亦需要血液的满养。中医学藏象学说，将脑的生理和病理统归于心而分属于五脏，认为心是“五脏六腑之大主[19]”，人体脏腑器官的功能活动，气血津液的运行，以及脏腑之间的联系和协调，均须通过经络系统的运输传导、联络调节得以实现，并使之成为一个有机的整体[20]。心与脑的经络联系有：手少阴心经经目系入脑，其经别也与手太阳小肠经会于目内眦而入脑；心包络为心之包膜，与心密不可分，而手厥阴心包经络于上、中、下三焦，人之头部（包括脑）又归属上焦，这样，又加强了心与脑的联系；《素问骨空论》云：督脉者……，入络脑……上贯心”，通过督脉，加强了心与脑的联系；心与小肠相表里，而手太阳小肠经的经筋从目周入脑，这样，脑与心又多一条联系途径。以上为脑与心的直接联系。因此在心脑病症的治疗方面，临床或从心而治，或从脑而治，或心脑同冶，均能取得良好的疗效。可见，心与脑的关系是十分密切的。说明“心脑共主神明”实际上是以心主血脉为物质基础，联系心脑与络脉-血管系统理念相一致的整体观。
心经作为心所属经脉，与心有着密切的联系。手少阴心经起于心中，联系心系、肺、咽及目系，属心络小肠，浅出腋下，循行于上肢内侧后缘，止于小指桡侧端。其络脉在腕关节后一寸处分出上行，沿本经进入心中，向上联系舌相部，归属于眼与脑相连的系带。其经别分出后进入腋下两筋之间，归属于心脏，向上走到喉呢，成出面部，与手太阳小肠经会于目内眦。其经筋起于手小指内侧，结于碗豆骨处，向上结于肘内，交手太阴经筋伏行于孔头里，结于胸中，沿脑向下，联系于脐部。
（1）在生理上：手少阴心经加强了心与人体体表、官窍及其他脏腑之间的联系，如《灵枢海论》曰：“夫十二经脉者，内属于腑脏，外络于肢节”。
（2）从病理上：手少阴心经为病，就会表现为：咽喉干燥，心口痛，口渴；前臂麻木酸痛等，如《灵枢经脉》曰：“益干，心痛，渴而欲饮，是为臂厥”。《灵枢本神》：“心藏脉，脉舍神，心气虚则悲，实则笑不休”。《灵枢五邪》：“邪在心，则病心痛，喜悲，时眩仆……”。
（3）治疗上：手少阴心经可以治疗与心相关疾病，如《素问刺热》：“心热病者，先不乐，数日乃热。热争则卒心痛，烦闷善喉，头痛、面赤无汗……刺手少阴、太阳”，宋王惟一《新铸铜人腧穴针灸图经》曰：“灵道治心痛悲恐”。
心经与脑关系也很密切。其经络经目系入脑，其经别也与手太阳小肠经会于目内眦而入脑。正是基于此理论，历代医家在治疗与脑相关疾病时，都会用到手少阴心经的相关经穴。如王惟一《新铸铜人腧穴针灸图经》曰：“少海治寒热齿麟痛，目瞭发狂”。皇甫谨《针灸曱乙经卷七》曰：“风陵头痛，少海主之”。杨继洲《针灸大成》：“神门去心性之呆疾”。徐凤《针灸大全》：“心中惊悸，言语错乱，取少海二穴，少府二穴，心命二穴”，心性呆疾，悲泣不已，取通里二穴，后溪二穴，神门二穴，大钟二穴”。近代医家根据以上理论，取手少阴心经的相关经穴治疗与脑相关疾病如失眠、郁证、中风、癲痫、痴呆、脑萎、神经衰弱等疾病，都有十分确切地疗效。
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