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摘要：目的检测proNGF(precursor-nerve growth factor)在大鼠缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion）心肌中的表达变化，探讨proNGF在大鼠心肌I/R损伤中的作用。
方法采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠I/R损伤模型，雄性SD大鼠随机分为四组。第一组：Sham组10只，只穿线不结扎；第二组：缺血再灌注组10只，结扎左前降支30 min后松开橡胶管再灌注2 h。
实验结束后分别取各组心肌组织行TTC及伊文思蓝染色（Evans）双染色测定心肌梗死面积（infarct area，I），心肌危险区面积（risk area，R），心肌总面积（total area，T），并计算各组I/R及I/T比值；行免疫组化及免疫荧光定位观察proNGF、P75、Sortilin在心肌组织各区域中的表达情况；行Western Blot半定量检测上述蛋白在心肌组织中的表达差异。
统计学处理：采用SPSS 20.0统计软件，计量资料的实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组资料间的比较采用单因素方差分析（one way，ANOVA）及重复测量资料的方差分析（Repeated Measures和Multivariate），组间比较采用LSD，以P<0.05差异有统计学意义。
结果①proNGF、P75、Sortilin在大鼠心肌I/R损伤后的表达情况Sham组心肌细胞和血管内皮细胞均未见明显的免疫阳性细胞；缺血再灌注组心肌组织缺血危险区、梗死区免疫阳性细胞增多；WesternBlot结果显示缺血再灌注组心肌组织proNGF、P75、Sortilin表达较Sham组明显上调。②Evans及TTC双染色测定心肌危险区和心肌梗死区面积实验组与Sham组I/R，I/T比值差异均有显著地统计学差异（P<0.05）。
结论proNGF及其受体在再灌注损伤后表达明显增多，推测proNGF可能通过p75NTR及Sortilin参与了大鼠心肌I/R损伤的病理进程。
关键词：proNGF；P75；Sortilin；缺血再灌注损伤
本文引用格式：刘政,于蓉,阮溦,等.proNGF在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(51):118-119.
0引言
为了进一步证实我们的研究猜想proNGF可能通过p75NTR及Sortilin参与了大鼠MIRI的病理进程，我们需要同步检测心肌组织中NGF的表达变化，并通过阻断proNGF的效应及过表达proNGF以观察其对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，通过观察心肌梗死范围的变化、心功能的改变，细胞凋亡情况，以及通过检测与proNGF促进神经元凋亡信号通路相似的一系列凋亡蛋白酶的表达变化，以明确其对心肌缺血再灌注损伤的作用及其具体作用机制。
1材料和方法
1.1材料和试剂。SD雄性大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证编号）。主要试剂：ProNGF、P75、Evans、TTC、BSA为美国sigma公司产品，Sortilin、荧光素标记的二抗为Abcam公司产品，0.9%Nacl、10%水合氯醛为湘雅二医院自制，PBS为北京中杉金桥产品，OCT为SAKURA公司产品，0.22um PVDF膜、ECL发光液为Millipore公司产品，蛋白酶抑制剂、TUNEL试剂盒为Roche公司产品，配胶试剂盒为碧云天产品，免疫组化试剂盒为优宁维产品，CD3为Santacrutz公司产品，GAPDH为Proteintech公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法。大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立：采用可逆性结扎左前降支建立大鼠I/R损伤模型[1-3，8]，SD雄性大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 mg），待夹尾反射消失后，颈胸部剃毛，经口光纤引导下插入气管导管（16G一次性静脉穿刺套管），连接呼吸机正压辅助呼吸，潮气量20 mL/kg，吸呼比1:1，呼吸频率65次/分，观察双侧胸廓起伏良好，双肺听诊呼吸音清，两边对称后，胶带固定好气管导管。
仰卧位固定大鼠于动物手术台上，针形电极扎入四肢皮下，观察记录标准肢体II导联心电图。络合碘消毒，于胸骨左缘3，4肋间切开皮肤，上下纵行延伸约2cm，用止血钳逐层钝性分离皮下组织、肌肉，用4-0线吊线分离胸大肌胸小肌，沿三四肋间隙向左腋下剪开肋间肌约2 cm，放入肋间撑开器，充分暴露心脏，剪开心包，在前室间沟可见到心大静脉，以此为标志在肺动脉圆锥及左房下缘交界处下约2 mm处用无菌6-0医用带针线绕过动脉深面，进针宽度约2 mm，深度约1 mm。把丝线两端从一直径2 mm聚乙烯（PE）管中间穿出备用。稳定10 min后，用一小的止血钳将PE管向前推直至阻断冠状动脉血流，止血钳上齿夹紧PE管，将心脏恢复至生理位置，开始计时，30 min后松开PE管再灌注2h，观察并记录结扎前后、再灌注时大鼠心电图[4-7]。
1.3统计学处理。所有计量资料数据以均数士标准差（±s）表示，采用SPSS 20.0统计学软件（IBM公司，美国）进行统计分析。实验数据采用Levene检验方差齐性，正态分布资料方差齐同下采用单因素方差分（ANOVA）分析多个样本资料，各组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立成功的鉴定。通过比较结扎前后心电图，可见结扎后ST段弓背或水平抬高，左室前壁心尖部颜色变白、室壁运动减弱，以上客观表现可作为结扎成功的标志；
松开止血钳，行LAD再灌，可见苍白的心脏表面逐渐充血变红，可伴随出现各种心律失常，最常见的是室性心动过速，抬高的ST段逐渐恢复表明心肌组织成功恢复再灌注2.2I30 min/R2h后大鼠心肌梗死情况。TTC及伊文思蓝双染色可以看到，在形态学方面，I30 min/R2 h组，不同大鼠心脏同一切面梗死区面积，缺血危险区的面积基本相同，即我们所建立的缺血再灌注损伤模型的稳定性较好，实验结果可信度高（见图1，表1）。
（A-C）分别示 I30 min/R2 h 组不同大鼠心脏同一切面，心肌组织中白色区域（黑色五角星所示）为心梗部位，因坏死的心肌细胞中无脱氢酶因而不能与 TTC 反应，故呈现苍白色；砖红色区域为缺血危险区，黑红色区域为正常心肌组织。
2.3proNGF、Sortilin、p75NTR在大鼠I/R心肌组织的表达。通过WesternBlot的计算机条带扫描图可以看到，在蛋白上样量基本相同的条件下，即内参GAPDH齐的前提下，与Sham组相比，I30 min/R2 h组条带明显增粗，而其他组与Sham组相比，条带无明显变化。
进一步行统计学分析可知，以GAPDH为内参，对各组的目的蛋白的表达量进行比较，各目的条带的净光密度值（IOD）分别代表各组目的蛋白的相对含量，利用统计软件SPSS 20.0中一般线性模型的重复测量对实验数据进行重复测量的方差分析，并进行不同组间的两两比较，以P<0.05差异有统计学意义。可见与Sham组相比，I30 min/R2 h组proNGF、Sortilin、p75NTR这三个目的蛋白的表达均有上调，差异有显著性（P<0.05），其他实验组与Sham组相比，目的蛋白的表达有改变但无统计学差异。
2.4proNGF、Sortilin、p75NTR在大鼠I/R心肌组织的表达定位。采用免疫荧光三标的方法定位观察上述蛋白的表达定位，Sham组心肌细胞（红色荧光标记）和血管内皮细胞（红色荧光）均未见明显目的蛋白（绿色荧光），I30 min/R2 h组血管内皮细胞及心肌细胞上有目的蛋白的表达，与心肌细胞及血管内皮细胞的标记部位重合，呈现出黄色荧光，即目的蛋白proNGF、Sortilin、P75NTR的表达部位在心肌细胞及血管内皮细胞。（见图2，图3）。
图2中微血管内皮用CD31（红色荧光）标记，细胞核呈蓝色，目的蛋白proNGF、p75NTR、Sortilin呈绿色荧光。（A-C）分别为Sham组proNGF、p75NTR、Sortilin的定位情况，（D-E）分别为I30min/R2h组proNGFp75NTR、Sortilin的定位情况，图中箭头表示血管部位。（×400）。
图3中心肌细胞用Sarcomeric（红色荧光）标记，细胞核呈蓝色，目的蛋白proNGF、p75NTR、Sortilin呈绿色荧光。（G-I）分别为Sham组proNGF、p75NTR、Sortilin的定位情况，（J-L）分别为I30 min/R2 h组proNGF、p75NTR、Sortilin的定位情况。（×400）。
3讨论
本研究发现与假手术组相比，单纯缺血30 min组及I30 min/R30 min组目的蛋白含量无明显改变，而I30 min/
R2 h组proNGF及其受体的表达是明显增高的，而再灌8h时，其表达量又逐渐恢复到基础水平，我们猜想这一表达变化可能是由于在再灌注的初期，机体内源性的保护机制可以将一定范围内的proNGF转化为其成熟形式，使其表达含量无明显变化，随着再灌注的进行，在大部分心肌组织恢复灌注，但功能尚未完全恢复的过程中，proNGF的表达逐渐增加，当其含量达到一定水平时，超过了机体的转化能力，使proNGF以原形的形式在心肌组织中大量堆积，因而可以通过WesternBlot的方法检测到其表达改变，在这一阶段，proNGF可能通过其同向表达变化的受体发挥促进细胞凋亡的作用。
伴随再灌注的持续进行，心肌细胞的功能进一步恢复，细胞内外的各种蛋白水解酶及其他保护机制的激活，使proNGF的含量又逐渐恢复到正常水平，因而在再灌注的后期即8h时我们检测到的proNGF水平与假手术组相比，无明显差异性。在上述定量观察的基础上，我们进一步定位观察了上述蛋白的表达部位，与之前的研究结果相符，在病理条件下，如缺血再灌注损伤时，proNGF及其受体在心肌细胞及血管内皮部位有表达。
综上所述，我们的研究证实，proNGF可能是通过P75及Sortilin参与了大鼠MIRI的病理进程的。
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