摘要：用网络药理学和分子对接技术探究常山治疗球虫病分子作用机制。通过检索中药系统药理学数据库收集常山主要活性成分及其作用靶点；借助基因名片数据库和疾病相关基因数据库检索球虫病潜在靶点，用蛋白质数据库筛选出常山与球虫病共同作用靶标，构建“药物—活性成分—疾病靶点”互作网络图。用微生信平台进行基因本体功能和京都基因与基因百科全书通路富集分析，进一步阐明“药物—活性成分—疾病靶点—信号通路”生物过程及相互作用。使用分子对接软件对结合最强活性成分与潜在靶点进行分子对接验证。常山可能通过MOL008191、常山酮等14个主要活性成分作用于球虫病Toll样受体4、胱天蛋白酶1等22个关键靶点，通过影响NOD样受体、C型血凝素受体等4条信号传导通路在多靶标作用下达到治疗球虫病目的。分子对接结果显示，主要活性成分MOL008191和常山酮与多个度值较高关键靶点具有较强结合稳定性。常山通过多种活性成分作用于球虫病多个靶点蛋白，借助免疫系统等信号调控机制完成对球虫病治疗作用。
关键词：常山,球虫病,药理学,分子对接
0引言
球虫病是一种严重威胁鸡健康的肠道原虫病，给养殖业造成巨大经济损失[1]。抗生素长期使用导致药物残留、机体耐药性和环境污染问题日趋严重[2]。常山具有涌吐痰涎和截疟功效，被应用于球虫病预防和治疗中。梁友萍等[3]报道单方制剂常山属驱虫杀虫类，具有较高抗球虫指数，对自然感染和人工感染球虫病鸡都具有显著疗效。罗晓琴等[4]试验发现常山口服液抗球虫效果较好，且具有促生长特性。复方制剂鸡球虫抗球虫指数160以上，抗球虫效果显著。目前，相关研究多集中在药效学方面，单味常山治疗球虫病可行性与分子网络调控机制研究尚无系统性文献。网络药理学从分子层面研究药物治疗成分、靶点和途径之间相互作用，近年在寄生虫病研究中发挥重要作用[5-7]。本研究采用网络药理学和分子对接技术，对常山成分进行分析，旨在探究其治疗球虫病复杂成分—靶点相互作用机制，为常山治疗球虫病机理研究提供理论参考。
1材料与方法
1.1活性成分及靶点筛选
利用中药系统药理学数据库（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com）进行活性成分筛选；使用SwissADME数据库（http://www.swissadme.ch）检索活性成分潜在靶点。
1.2疾病相关靶点筛选
采用基因名片数据库（Gene Cards,https://www gene cards.org）和孟德尔人类遗传数据库（OMIM,https://www.omim.org/）进行疾病靶点搜索和整理。
1.3交集靶点筛选及蛋白质互作网络构建
使用韦恩数据处理工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行药物与疾病交集靶点识别；利用STRING数据库（https://string-db.org/）构建蛋白质互作网络；运用Cytoscape 3.9.1软件筛选核心靶点绘制PPI网络图，直观展示靶点间相互作用情况。
1.4药物—活性成分—治疗靶点网络图
将药物活性成分靶点、疾病靶点和共交集靶点信息进行整理，导入Cytoscape软件构建药物—活性成分—治疗靶点网络图。
1.5 GO功能与KEGG通路富集分析
应用DAVID数据库（https://DAVID.ncifcrf.gov/）进行共交集靶基因富集分析，物种设定为鸡（Gallus gallus）。通过微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn）构建靶基因基因本体（GO）功能图及京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析通路图。
1.6分子对接
使用Pymol 2.5.0软件和Auto Dock Tools分子对接软件对Pubchem网站获取的常山主要活性成分3D结构文件进行转化和优化；对从RCSB PDB数据库（https://www.RCSB PDBus.org/）获取核心靶点三维结构信息进行水分子和原始配体去除及加氢和电荷计算处理；再使用对接软件进行活性成分与靶点蛋白分子对接试验，并通过Pymol进行结果可视化。
2结果与分析
2.1活性成分及靶点获取
本研究共检索出常山17种活性成分，经过有效性筛选分析获取14种活性成分，通过活性成分作用相关靶点蛋白分析最终确定440个与活性成分相关靶蛋白。
2.2疾病相关靶点筛选和交集靶点获取
通过疾病检索数据库信息检索和筛选共获得676个球虫病潜在靶点。使用维恩数据处理工具成功识别出22个共交集靶点，见图1。
2.3药物与疾病靶点PPI网络图
通过构建常山与球虫病靶点PPI网络图，见图2。蛋白互作网络参数分析，中心度值排名前十关键靶蛋白基因为TLR4、CASP1、TLR9、CASP8、IDO1、CXCR2、PRKCD、EIF2AK2、SELP和LCK。
2.4药物—活性成分—治疗靶点网络图
由图3所示，14个活性成分与22个交集靶点互作：绿色三角形代表常山，绿色椭圆形代表有效活性成分，橙色为治疗疾病靶点，每条边代表靶点之间互作关系。图中显示MOL008184、MOL008191、MOL008193 3种化合物所对应活性成分关联线条数最多，表明其在整个互作网络中占有核心地位，在常山药效中发挥重要作用。
2.5 GO功能与KEGG通路富集分析
GO功能分析显示，生物过程（BP）主要富集在蛋白水解作用、蛋白质磷酸化和磷脂酰肌醇-3-磷酸生物合成过程；细胞成分（CC）主要富集在等离子体膜、胞质和磷脂酰肌醇3-激酶复合物；分子功能（MF）主要富集在ATP结合、金属离子结合和金属内肽酶活性等方面，见图4。
KEGG通路富集分析表明，4条代谢通路与常山治疗球虫病有关，见图5。其中关键靶标P2RX7、CASP8、PRKCD等调控NOD样受体信号通路（gga04621）；CASP8、PRKCD、CASP1等调节C型血凝素受体信号通路（gga04625）；CASP8、PIK3CD、TLR4调控Toll样受体信号通路（gga04620），其中靶基因CASP1、CASP8和PIK3CD参与调控的信号通路最多，可能是靶基因间相互作用关系。
使用Cytoscape软件绘制药物—活性成分—靶点—疾病—信号通路图，进一步展示其关联性，见图6。
2.6分子对接结果
将蛋白质互作网络图中度值排名前十的蛋白基因与药物疾病靶点图中度值排名前三的药物活性成分进行分子对接。其中，EIF2AK2、LCK和PRKCD与4种药物活性成分表现出较强的结合能力；前10个靶点中除TLR9和EIF2AK2显示出与MOL008197（常山酮）高结合能力外，其余靶点都与MOL008191具有较高的结合能力。
使用Pymol软件进行分子对接过程可视化处理，见图7，直观地展示配体和靶点蛋白之间的空间结合模式。
3结论
本研究通过网络药理学和分子对接技术探究常山治疗球虫病分子作用机制，数据库检索发现常山具有谷甾醇、MOL008191和常山酮等14种有效活性成分。通过与球虫病CASP1、CASP8、PIK3CD等22个关键靶点蛋白互作，调控NLR、TLR、CtLR等信号通路，主要作用于机体血液免疫系统而达到治疗球虫病的综合治疗作用。
参考文献
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