SCI论文（www.lunwensci.com）
摘要 ：针对病原体的核酸即时检测需求， 设计了一种集核酸提取和扩增功能于一体的微流控芯片， 利用一次性注射器驱动芯片上 的液体流动， 借助紫外线验钞笔便可用肉眼直接读出核酸检测结果 。芯片分为提取区 、混合区和扩增区， 在提取区设计了裂解池 和清洗池， 利用磁珠法完成核酸提取; 在混合区设计了洗脱池 、扩增试剂池和方波型混合器， 用于核酸的洗脱以及与扩增试剂的 混合; 在扩增区， 为了实现多靶标检测， 一共设计了 16 个扩增反应池， 采用一种滑动式芯片结构， 实现各反应池之间的物理隔 离 。采用模拟仿真和实验， 对方波混合器的混合性能进行了验证， 表明其可以实现核酸洗脱液与扩增试剂的均匀混合 。在微流控 芯片上， 利用荧光素钠溶液模拟了环介导等温扩增反应过程， 证明了滑动式扩增反应池结构能够满足多靶标检测的物理隔离要求。
关键词 ：病原体,核酸,即时检测,微流控芯片
A Fully Integrated Microfluidic Chip for Nucleic Acid Point-of-Care Testing
Yang Furui， Wu Mengxi， Liu Junshan ※
( Key Laboratory for Micro/Nano Technology and System of Liaoning Province, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024. China) Abstract: To address the demand for point-of-care testing of nucleic acids of pathogens, a microfluidic chip integrated nucleic acid extraction and amplification functions was designed, a disposable syringe was used to drive liquid flow on the chip, and with the help of an ultraviolet money detector pen, the nucleic acid detection results could be read directly with the naked eye . The microfluidic chip was divided into extraction region, mix region and amplification region. In the extraction region, there were lysis chamber and wash chambers, and the nucleic acid extraction was conducted by a magnetic bead-based method . In the mix region, there were an elution chamber, an amplification reagent pool and a square-wave-shaped mixerfor eluting nucleic acid and mixing with the amplification reagent . In the amplification region, there were 16 amplification reaction chambers for multiplexed detection, and physical isolation among the chambers were realized by a slip chip structure . The mixing performance of the square-wave-shaped mixer was tested by simulation and experiment , and the results demonstrated that the eluted nucleic acid solution and the amplification reagent could be mixed uniformly . The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction was simulated by fluorescein sodium solution on the microfluidic chip, and it was proved that the slipchip-structure amplification chambers could meet the physical isolation requirements of multiplexed detection .
Key words: pathogen; nucleic acid; point-of-caretesting; microfluidic chip
引言
病原体严重威胁人类生命健康和社会经济发展[1]。 病原体的检测方法包括核酸检测 、抗原抗体检测 、分离 培养等 。其中， 核酸检测具有高灵敏度和高特异性等优 点， 已成为病原体检测的金标准 。基于常规聚合酶链式 反应 ( PCR ) 的核酸检测需要在 3 个不同温度之间进行 几十次的扩增循环， 操作复杂 、耗时长 。因此， 研究人 员开发了多种基于等温扩增的核酸检测技术， 例如环介 导等温扩增 ( LAMP ) [2-3]， 在恒定温度下较短时间内便 可以完成核酸检测过程。
现场即时检测 ( Point-of-care Testing, POCT ) 与传 统的病原学检测方法相比， 具有操作简单 、快速等特 点[4]， 在疫情防控等领域极具应用潜力 。微流控芯片具有微型化 、集成化和便携化等特点， 特别适合用于核酸 的即时检测 。然而， 目前大多数基于微流控芯片的核酸 检 测 系 统 需 要 复 杂 昂 贵 的 检 测 设 备 和 液 体 驱 动 设 备 等[5-7] 。例如， 2010 年， 德国弗赖堡大学的 Lutz 等[8]研制 的微流控检测系统需要离心设备进行芯片上的液体驱动。 2021 年， 北京航空航天大学研制了一种全集成微流控芯 片， 利用指压便可以实现芯片上的液体驱动， 借助紫外 灯可以用肉眼读出检测结果， 实现了结核杆菌的现场即 时检测[9] 。但是， 为了实现多靶标检测， 该芯片需要利 用复杂的阀结构实现扩增反应池间的物理隔离 。2009 年， 美国芝加哥大学的 Du 等[10]提出了一种滑动式结构的 微流控芯片， 在芯片的基片上制作出微沟道， 在芯片的 滑动片上制作出液体腔室， 利用两片之间的相对滑动，
便可以实现不同液体腔室间的连通或者隔离 。之后， 又 有多位学者对滑动式结构的微流控芯片进行了相关研究。 例如， 2011 年， 美国芝加哥大学的 Shen 等[11]研制了一种 只有硬币大小的旋转式滑动芯片， 可以连续生成纳升级 液滴， 用于定量检测 HIV 和 HCV 病毒。
为此， 本文针对核酸现场即时检测的需求设计了一 种基于 LAMP 技术的全集成微流控芯片， 能够完成核酸 的提取和扩增功能， 利用一次性注射器进行芯片上的液 体驱动， 借助紫外线验钞笔便可用肉眼直接读出核酸检 测结果 。而且， 在芯片的扩增区域采用了滑动式芯片结 构， 实现了 16 个扩增反应池之间的物理隔离， 因此该芯 片可用于多靶标检测。
1 芯片的设计
图 1 (a) 为本文设计的全集成微流控芯片的结构示 意图， 在芯片的基片上制作了微通道和试剂池等结构 。 根据功能， 将芯片分为 3 个区域： 核酸提取区 、混合区 和扩增区， 如图 1 (b) 所示。
( 1 ) 核酸提取区 。为了实现便携化操作， 选择了磁 珠法进行核酸的提取， 为此该区域设计了 4 个试剂池： 磁珠池 、裂解池 、清洗池 1 和清洗池 2 。磁珠法的基本原 理为： 磁性纳米颗粒可以与核酸分子特异性结合， 利用 磁场操控磁性颗粒运动， 便可以在不同区域分别实现裂 解 、清洗等核酸提取步骤。
( 2 ) 混合区 。该区域设计了 1 个洗脱池 、1 个扩增试 剂池和 1 个方波混合器， 主要用于实现核酸的洗脱以及 与扩增试剂的充分混合 。为了便于操作和缩短检测时间， 选择了 LAMP 扩增法， 因此在扩增试剂池里存放 LAMP Mix 试剂。
( 3 ) 扩增区 。为了实现多靶标核酸检测， 在该区域 采用了滑动式芯片结构 。在基片上设计了用于液体流动的微沟道， 在滑动盖片上设计了 16 个扩增反应池， 利用 低熔点石蜡 ( 48~50 ℃) 将扩增引物预先包埋在各个反 应池内 。当需要将待测溶液引入扩增反应池时， 移动盖 片使反应池与微沟道连通， 此时由于引物被石蜡包埋在 反应池底部， 因此不会发生反应池间引物相互混合的现 象 。当需要进行扩增反应时， 移动盖片使反应池与微沟 道断开， 从而实现各反应池之间的彻底物理隔离。
图 1 (c) 所示为采用精密铣削制作出的聚碳酸酯 ( PC ) 微流控芯片， 图 1 (d) 所示为则为注入各种试剂 后的芯片照片。
2 芯片的操作步骤
芯片的操作步骤包括实验前的芯片预备步骤和核酸 检测步骤 。其中， 预备步骤主要包括： ( 1 ) 利用移液枪 将不同类型的扩增引物加入扩增反应池中， 然后将低熔 点石蜡融化后依次加入各反应池， 待石蜡由液态转为固 态时， 引物便被包埋在反应池底部; (2 ) 将磁珠 、裂解 液 、清洗液 1 、清洗液 2 、洗脱液和 LAMP Mix 试剂加入 各储液池中， 然后利用胶带将注液孔密封; (3 ) 在滑动 盖片与基片之间涂覆少许无菌液体石蜡， 保证两片紧密 贴合。
核酸检测步骤主要包括： ( 1 ) 将 20 μL 样品注入裂 解池， 在室温下保持 5 min， 完成裂解过程; (2 ) 利用一 根钕铁硼永磁棒移动磁珠， 使其依次通过清洗池 1 、清 洗池 2 和洗脱池， 磁珠在两个清洗池处各停留 1 min， 洗 去残留的蛋白质等杂质， 在洗脱池中停留 3 min， 使核酸 脱落磁珠表面， 然后将磁珠移回清洗池 2 中; (3 ) 利用 一次性注射器， 手动向芯片内缓慢加压， 使核酸洗脱液 与 LAMPMix 试剂同时进入方波混合器， 得到混合均匀的 待测溶液; (4 ) 再次加压， 将待测溶液注入 16 个扩增反 应池中， 将滑动盖片向上推移， 反应池间实现物理隔离; ( 5 ) 将芯片升温至 65 ℃， 保持 40 min， 完成核酸扩增; ( 6 ) 利用波长为 365 nm 的紫外线验钞笔依次照射各反应 池， 发生了扩增反应的样品池在照射下会发出明亮的绿 色荧光， 而未发生扩增反应的样品池则暗淡无光。
3 结果与讨论
3.1 方波混合器
方波混合器是微流控领域中常用的一种二维混合器， 主要利用尖角处的湍流和层流间的液体扩散来完成溶液 混合[12] 。根据 Chen 等[13]的研究， 在相同直径 、流速以及 纵向长度的情况下， 方波形的混合器比其他类型的混合 器效率更高 。为此， 结合全集成微流控芯片的外观尺寸， 对方波混合器的长度和直径进行了设计。
利用 COMSOL 软件对方波混合器的进样和混合效果 进行了模拟仿真 。在模拟气压推动液体进样时， 利用了 物理场中的两相流-水平集-层流 。如图 2 (a) 所示， 仿真结果表明， 在气体压强和受压面积相当的条件下， 洗 脱池与扩增试剂池中的液体 (红色) 可在空气 (蓝色) 的挤压下同时完成进样 。 图 2 (b) 为对应的实验结果， 可见仿真与实验结果基本一致。
在模拟混合效果时， 采用了物理场中的单相流-层流， 建立的仿真模型如图 3 (a) 所示， 进样速度设置为 50 mm/s 。利用参数扫描， 研究了扩散系数对于出口浓度 的影响 (图 3 (b) )， 以及入口浓度对于混合效率的影 响 (图 3 (c) )。 水溶液常温条件下扩散系数为 10- 10~ 10-9 m2/s 之 间， 这 里 将 扩 散 系 数 设 置 为： 1×10- 11~ 1× 10-9 m2/s， 而入口浓度设置为： 1~50 mol/m3 。可以看出扩 散系数和入口浓度均不会影响液体的方波混合器的混合 结果。同样， 利用蓝红两种液体， 对方波混合器的混合效 果进行了实验验证 。如图 3 (d) 所示， 两种颜色的液体 经过方波混合器后得到了充分混合， 形成了均匀的紫色。
3.2 滑动式扩增反应池
利用荧光素钠溶液对滑动式扩增反应池的物理隔离 效果进行了实验验证 。首先， 在相互间隔的 8 个反应池 中加入相同浓度的荧光素钠溶液， 待其风干后用石蜡对 其进行包裹 。其次， 移动盖片使反应池与微沟道连通， 向反应池中注入去离子水 。接着， 将滑动盖片向上推移， 使 16 个反应池实现物理隔离 。然后， 将芯片放置到加热 板上进行加热， 在 65 ℃保持 40min 。最后， 利用紫外线 验钞笔对芯片进行照射 。如图 4 (a) 所示， 8 个加入了 荧光素钠的反应池发出了绿色荧光， 而其他 8 个反应池 则没有荧光产生， 表明本文设计的滑动式结构可以在没 有任何阀结构的情况下实现反应池间的物理隔离。
此外， 还利用荧光显微镜对芯片进行了拍摄 (荧光 波长为 350~500 nm)， 采用 ImageJ 图像软件对 8 个加入荧光素钠反应池的荧光面积和荧光强度进行了计算 。如图 4 (b) 所示， 8 个反应池的荧光面积基本一致， 表明初 始加入的石蜡量不会影响阳性结果的判定 。8 个反应池 的均一化荧光强度基本相等， 证明注入的去离子水能够 与各扩增池中的荧光素钠完全混合， 进一步证明了该滑 动式扩增反应池可以满足多靶标核酸检测的要求。
4 结束语
本文设计了一种基于 LAMP 技术的微流控芯片， 只 需要一个一次性注射器和一支紫外线验钞笔， 便能够实 现核酸的提取 、扩增和检测功能， 未来有望用于病原体 的核酸即时检测 。将芯片分成了 3 个功能区： 核酸提取区 、混合区和核酸扩增区， 对各功能区内的储液池和微沟道等进行了设计， 探讨了核酸的提取和扩增方案， 分 析了芯片的工作流程 。利用 COMSOL 软件对芯片上的方 波混合器进行了模拟仿真， 并进行了实验测试， 检验了 混合器的液体混合能力 。利用荧光素钠溶液， 对芯片上 的滑动式扩增反应池的物理隔离性能进行了测试， 实验 结果表明该结构能够在核酸扩增反应过程中实现反应池 间的物理隔离， 满足了芯片多靶标核酸检测的要求。
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