SCI论文（www.lunwensci.com）
摘要：针对病原体核酸现场即时检测的需求， 研发了一种基于等温扩增的便携式核酸检测系统。主要由温度控制模块、样品移动 模块和荧光检测模块组成， 可以同时检测 16 个样品。温度控制模块使用半导体制冷片作为变温元件， 控温精度为±0. 1 ℃。样品移 动平台基于 CoreXY平面运动结构， 采用同步带传动， 显著减轻了检测系统的重量。荧光检测模块采用发光二极管和硅光电二极管 作为激发光源和荧光探测器， 具有尺寸小、功耗低等特点。上述 3 个模块均通过下位单片机进行控制， 单片机通过串口与具有人 机交互功能的上位工控机进行通信， 然后利用开发的控制软件进行检测参数的设置。利用研发的系统对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行 了基于环介导等温扩增的核酸检测实验， 在 45 min 内便获得了检测结果。
关键词：核酸检测,等温扩增,检测系统,便携式
A Portable Nucleic Acid Detection System Based on Isothermal Amplification
Tan Zhiguang， Xu Zheng， Wu Mengxi， Liu Junshan ※
(Key Laboratory for Micro/Nano Technology and System of Liaoning Province, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024. China)
Abstract: A portable nucleic acid detection system based on isothermal amplification was developed for point-of-care testing of nucleic acids of pathogens. The system mainly consisted of a temperature control module, a sample movement module and a fluorescence detection module,and it could test 16 samples simultaneously. Semiconductor chilling plates were used as the temperature adjusting element of the temperature control module, and the temperature control accuracy was ±0. 1℃ . The sample movement module took a CoreXY planar motion structure, and synchronous belts were used for transmission, which dramatically decreased the weight of the detection system . The light emitting diode (LED) and silicon photodiode were used as the excitation light source and fluorescence detector of the fluorescence detection module, respectively,and therefore this module had a small dimension and low power consumption. The above three modules were controlled by the lower micro control unit (MCU), the MCU communicated with the upper industrial personal computer (IPC) with human-computer interaction function through the serial port, and the test parameters were set by the developed control software. By this system, the cucumber green mottle mosaic virus was detected based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP), and the results were obtained within 45 minutes.
Key words: nucleic acid detection; isothermal amplification; detection system; portable
0 引言
聚合酶链式反应 (PCR) 具有较高的特异性和灵敏 度， 基于 PCR 的核酸检测已成为病原体检测的金标准。 PCR 通常需要经历 30~40 次的扩增循环才能达到检测所 需的浓度， 每次循环包含变性、退火和延伸 3 个反应步 骤， 分别需要在不同温度下进行。因此， 基于 PCR 的核 酸检测技术需要对反应温度进行反复的升降温控制， 无 法快速得到检测结果。为此， 研究人员开发了多种基于 等温扩增的核酸检测技术， 例如环介导等温扩增、重组 酶聚合酶扩增等。基于等温扩增的核酸检测过程不需要 进行不同温度之间的调整， 对温度控制系统的要求大大 降低， 并且不需要变温调整时间。美国疾病控制中心 的 Calvert 等[1] 基于逆转录环介导等温扩增技术开发了 快速检测尿液或血清中寨卡病毒的分析方法， 能够在20~35 min 的时间内获得检测结果。清华大学的 Lin 等[2] 设计了基于微流控芯片的便携式系统， 利用逆转录环介 导等温扩增技术能够在 50 min 内同时检测 4 种 Ebola 病毒。
现场即时检测 (Point-of-care testing， POCT ) [3-4] 是 指利用便携式分析设备， 在患者附近即可进行的现场检 测， 具有操作简单、快速等特点， 在疫情防控、海关及 检验检疫等领域具有广泛应用前景。日本东北大学的 Wakao 等[5] 搭建了微型装置的便携式荧光偏振免疫分析 仪， 尺寸为 35 cm×15 cm×15 cm， 能够同时对 96 个独立 样本中的真菌毒素进行荧光偏振免疫分析。德国杜伊斯 堡 -埃森大学的 Tran 等[6] 设计了一种便携式拉曼/SERS- LFA 读写器， 采用定制的光纤探针实现了对妊娠激素人 绒毛膜促性腺激素 (hGG) 以及两种细胞因子 IL6 和 IL8 的检测， 能够在数秒时间内获得检测结果。基于核酸扩增的 POCT 技术还相对较少， 这主要是由于大多数的核 酸检测系统体积庞大， 操作复杂， 无法满足便携化的要求。
为此， 本文设计制作了一种基于等温扩增的便携式 核酸检测系统， 通过轻量化设计等使其便于携带和操 作， 而且检测快速， 因此有望用于病原体核酸的现场即 时检测。
1 总体方案设计
本文设计的核酸检测系统主要包括温度控制模块、 荧光检测模块和样品移动模块， 如图 1 所示。其中， 温 度控制模块能够提供核酸扩增过程所需的温度， 确保反 应正常高效进行。荧光检测模块提供检测所需的激发光， 同时将核酸扩增产物的荧光信号采集后进行模数转换以 供后续处理。样品移动模块能够移动温度控制模块对 16 个 PCR 管进行逐个扫描， 使得检测系统最多可实现 16 个 样品的同时检测， 提高了检测通量。同时， 该系统还配 备了一台高性能工控一体机， 负责进行人机交互， 方便 操作人员进行检测条件设置和实验结果实时分析。如图 1 所示， 基于 STM32 单片机设计了带有多路串口通信和 步进电机控制脉冲发生器的主控板， 系统的 3 个功能模 块通过下位主控板进行协调与控制。其中， 温度控制器、 荧光检测装置以及上位工控机经过 RS-232 串行接口总线 进行指令和数据传输; 样品移动模块通过步进电机驱动 器由 STM32 单片机的定时器外设产生数字脉冲信号进行 控制。此外， 为了使检测系统能够实现室外操作的便携 化， 设计的 3 个功能模块均可以利用 24 V 直流电池进行 供电。
2 功能模块设计与搭建
2.1 温度控制模块
半导体制冷片是一种基于帕尔贴效应， 通过调节电 流的方向能够对外界进行加热或制冷的热电器件。它具 有体积小、热惯性小、无噪声、可快速变温等优点， 被 广泛用于核酸扩增仪器的温度控制[7- 10]。本文以半导体 制冷片为核心设计了温度控制模块， 如图 2 所示。半导体制冷片的非工作面采用定制的全铜针式散热器进行散热， 通过在散热器外表面涂敷碳纳米管以及安装风扇加速空气流动增强其与空气换热。半导体制冷片的工作面直接与可同时放置16 个 PCR管的加热台接触， 实现对 PCR管的均匀传热。为了提高升降温速率， 对加热台的体积进行了优化， 使其热容量尽量减小， 从 而降低变温过程所需的能量。为了保证各 PCR 管之间温 度分布的均匀性， 材料选用了导热性能优良的无氧铜。 此外， 为了减小外界环境对加热台温度的影响， 同时减 少非必要的热量散失， 利用尼龙外壳对加热台进行了包 裹， 并在其内部填充了纳米气凝胶隔热毡。
选用双通道数字温度控制器对半导体制冷片进行控 制， 采用了开关模式电源技术， 能够高效地控制电流。 控制器的工作电压为 24 V， 输出经滤波后电流纹波小， 可以减小对半导体制冷片的电流冲击， 延长其使用寿命。 利用热电阻进行温度反馈， 通过调节控制器的 PID 参数， 温度控制模块的平均升温速率为 2.5 ℃/s， 升温速率较快 可以减小前期预热时间。该温度控制器的温度控制精度 为±0. 1 ℃， 可以满足等温扩增所需的温度控制要求。
2.2 荧光检测模块
荧光检测模块主要由具有 475 nm 激发波长和 525 nm 探测波长的高精度微型荧光探测器和恒流源组成。该模 块采用了正交式光路， 可以避免背景噪声对荧光值测量 结果的干扰。采用 LED 和硅光电二极管作为激发光源和 光探测器， 有效减小了系统的尺寸和功率。光探测器和 信号处理电路安装在同一电路板上， 经模数转换后通过 串口输出。相比于模拟信号， 数字信号输出具有更加优 秀的抗干扰能力， 同时这种模数转换的就近设计能够减 小噪声干扰， 确保光学检测的可靠性。此外， 检测的光 斑直径为 6.5 mm， 比 PCR 管的管口直径略大， 确保了足 够大的采光面积， 能够有效收集荧光信号。
2.3 样品移动模块
样品移动模块的主要作用是通过移动温度控制模块， 使得荧光检测模块能够对 16 个 PCR 管进行并行检测。
同步带传动方式具有平稳、静音等优点， 非常适合 轻便、轻载的应用场合， 因此本文参考 CoreXY平面运动 结构[11- 12]， 设计了基于同步带传动的样品移动模块， 如 图 3 所示。该模块具有 X 轴和 Y 轴两个直线运动自由度， 均采用步进电机进行驱动。模块的传动机构由 2 条同步 带和 7 个同步带带轮组成， 其中 2 个带轮连接步进电机的输出轴作为驱动轮。 2 个电机固定在机架上， 移动平台 的运动依赖于 2 个电机的协调动作， 这种设计显著减小 了移动模块的运动惯性， 使其运动状态切换更加灵活。
规定电机顺时钟转速为正， 得到移动平台的运动速度为：
− ω 1 d − ω 2 d 2
− ω 1 d + ω 2 d
vy = 2 ( 2 )
式中： vx 和 vy 分别为移动平台沿 X 轴和 Y轴方向的运动速 度; ω 1 和 ω 2 分别为左右电机的转速; d 为电机输出同步 带轮的直径。
为了保证步进电机的开环控制精度， 选用了五相步 进电机， 其基本步距角为 0.36°， 可进行 15 级细分， 有 利于在移动平台运动过程中减弱或消除步进电机的低频 振动， 同时也能够提高电机的角度定位精度。采用光电 开关实现移动平台的位置归零， 使用 S 型加减速算法确 保步进电机在启动和停止过程中速度和加速度的连续性， 减小冲击， 进一步提高运动平稳性。
2.4 系统控制软件
本文采用 7 inch 的工业平板电脑作为核酸检测系统 的上位机， 主要实现人机交互功能， 其他功能模块的控 制均由下位单片机实现。上位机通过 RS-232 总线将反应 参数和指令传递给下位单片机， 并从下位机读取温度和 荧光数据。采用 Python 编程语言， 基于 PyQt5 图形界面 框架， 设计开发了系统的图形化控制软件。该控制软件 可以显示检测系统的运行进度和状态， 以数值方式实时 显示加热台的温度值， 以及绘制荧光强度曲线。操作人 员只需手动将样品放置到加热台上， 点击“开始”按钮， 即可开始自动化的核酸检测。待检测结束后， 控制软件 会自动将温度和荧光强度数据保存至电脑， 用于后续的 分析处理。
3 系统的应用验证
本文使用浓度为 4.4×109 copies/µL 的黄瓜绿斑驳花叶病毒质粒作为测试样品， 基于环介导等温扩增技术对其 进行核酸检测。在加热台上随机选择了 4 个位置安放 4 个 PCR 管， 其中1 号、 2 号和 3 号 PCR 管内装有病毒质粒和 扩增反应试剂， 4 号 PCR 管内只有反应试剂作为实验的 阴性对照。温度控制参数为： 63 ℃， 15 s; 63 ℃， 45 s， 35 次温度循环。整个检测过程只需 45 min， 获得的核酸 扩增曲线如图 4 所示。从图中可以看出， 随着循环次数 的增加， 从 1 、2 、3 号 PCR 管中检测到的荧光信号强度逐渐增加， 最后趋于平衡;由于 4 号 PCR 管内没有病毒质粒， 因此从该管中检测到的荧光信号强度很弱，且不随循环次数的增加而发生变化。该实验证明了本文研制的系统可以很好地用于基于等温扩增的核酸检测。
4 结束语
本文设计制造了一种基于等温扩增的便携式核酸检 测系统。基于半导体制冷片构建的温度控制模块的控温 精度可以达到±0. 1 ℃; 采用LED 和硅光电二极管作为激 发光源和光探测器有效减小了荧光检测模块的尺寸和功 率， 高度集成的采集电路提高了光学检测的抗干扰能力; 参考 CoreXY平面运动结构设计的样品移动模块， 具有运 动平稳、噪声低等特点， 而且显著减轻了系统的重量。 操作人员通过上位工控机的控制软件进行检测参数设置， 发送给下位单片机控制上述模块完成检测。检测系统可 以采用 24 V 直流电池进行供电， 有利于室外操作的便携 化。利用该系统， 基于环介导等温扩增技术对黄瓜绿斑 驳花叶病毒质粒进行了核酸检测， 在 45 min 内获得了检 测结果。
参考文献：
[1] Calvert A E, Biggerstaff B J, Tanner N A, et al. Rapid colorimet⁃ ric detection of Zika virus from serum and urine specimens by re ⁃ verse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT- LAMP)[J]. PLoS One, 2017. 12(9): e0185340.
[2] Lin X, Jin X, Xu B, et al. Fast and parallel detection of four ebola virus species on a microfluidic-chip-based portable reverse tran ⁃ scription loop-mediated isothermal amplification system[J]. Mi⁃ cromachines, 2019. 10(11): 777.
[3] Vashist S K, Luppa P B, Yeo L Y, et al. Emerging technologies for next-generation point-of-care testing[J]. Trends in Biotech⁃ nology, 2015. 33(11): 692-705.
[4] He L, Sang B, Wu W. Battery-powered portable rotary real-time fluorescent qPCR with low energy consumption, low cost, and high throughput[J]. Biosensors-Basel, 2020. 10(5): 49.
[5] Wakao O, Nakamura A, Nishiyama K, et al. High-throughput flu⁃ orescence polarization immunoassay by using a portable fluores ⁃ cence polarization imaging analyzer[J]. Lab on a Chip, 2019. 19 (15): 2581-2588.
[6] Tran V, Walkenfort B, König M, et al. Rapid, quantitative, and ul⁃ trasensitive point-of-care testing: a portable SERS reader for lat⁃ eral flow assays in clinical chemistry[J]. Angewandte Chemie In⁃ ternational Edition, 2019. 58(2): 442-446.
[7] Nasser G A, Abdel-Mawgood A L, Abouelsoud A A, et al. New cost effective design of PCR heating cycler system using Peltier plate without the conventional heating block[J]. Journal of Me⁃ chanical Science and Technology, 2021. 35(7): 3259-3268.
[8] He H, Feng J H, Li K X. Development of a temperature control system based on DSP for a real-time PCR instrument[J]. Applied Mechanics and Materials, 2014(462-463): 549-552.
[9] Thakor M D, Hadia S K, Kumar A. Precise temperature control through Thermoelectric Cooler with PID controller[C]//2015 In⁃ternational Conference on Communications and Signal Process ⁃ ing (ICCSP), 2015.
[10] Robertson B I, Shin Y H, Choi J W. A thermoelectric tempera⁃ ture control module for a portable fluorescent sensing platform [J]. Journal of the Electrochemical Society, 2020. 167(14): 147505.
[11] Avdeev A R, Shvets A A, Torubarov I S. Investigation of kine ⁃ matics of 3D printer print head moving systems[C]//Proceedings of the 5th International Conference on Industrial Engineering, 2019.
[12] 丁承君, 韩承都 . CoreXY 机构 3D 打印机运动控制算法研究 [J]. 制造业自动化, 2019. 41(2): 81-85.
关注SCI论文创作发表，寻求SCI论文修改润色、SCI论文代发表等服务支撑，请锁定SCI论文网！
文章出自SCI论文网转载请注明出处：https://www.lunwensci.com/ligonglunwen/58275.html
