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摘要：以红菇为原料，按料液比1:10加入石油醚在80℃进行提取2h,抽滤、干燥后得到石油醚提取物；滤渣干燥后，用同样的方法依次加入乙酸乙酯、乙醇、蒸馏水，对干燥滤渣进行提取，分别得到乙酸乙酯提取物、乙醇提取物和水提取物。采用MTT法检测各提取物对MDA-MB-231（乳腺癌细胞）和Hela(子宫颈癌细胞)的细胞活性影响，并用细胞形态学进行观察。结果发现石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物对MDA-MB-231、Hela细胞都有抑制作用，且在一定浓度范围内随浓度增大抑制程度也增大，特别是石油醚提取物在浓度为140μg/mL时，对于MDA-MB-231细胞的抑制率达到51.16%，而乙醇提取物在浓度为100μg/mL时，对于MDA-MB-231细胞的抑制率达到55.39%。乙酸乙酯提取物在400、500μg/mL时影响效果更明显，抑制率达到90%以上。水提取物的抑制作用不明显。
关键词：红菇；提取物；MDA-MB-231；Hela；抗肿瘤
本文引用格式：任玉莹,等.红菇活性物质提取及体外抗肿瘤活性初探[J].教育现代化,2019,6(25):203-205.
一 引言
红菇（Russula）是一类大型菌根真菌，属担子菌亚门、层菌纲、红菇目、红菇科、红菇属。目前国际上已经报道了300多种红菇属真菌，而我国有90余种，多产于辽宁、福建、江苏、广西、四川、云南等地。大多种类的红菇属真菌是可以食用的，部分有毒，红菇有“菇中之王”的美称，含有丰富的营养物质，含有人体必需的多种氨基酸、红菇多糖，以及人体必需的矿物质等成分。红菇风味独特，脂肪含量低，与其他植物性食品相比，粗纤维的含量比较高，其纤维混以几丁质，具有特殊的生理活性。红菇也有不少药用功能，近年来，随着人们的研究不断进展，红菇的一些药理作用逐渐被发现和证实，红菇的抑菌效果特别好；红菇有清除自由基、降血糖、降血脂、增强人体免疫力、延缓疲劳、修复甲醛所致的氧化损伤等功效。另外，红菇对心、肝功能也很有益处[1]。国内外不少关于红菇的报道，主要集中在野生红菇的生态、资源、分离纯化和应用研究等方面。近年来，人们一直努力于解决肿瘤的问题，研究表明，多种红菇都有较强的抗肿瘤作用，对于肿瘤的抑制率能达到60%-80%，而对于红菇的抗肿瘤成分研究最多的是多糖，不少学者均发现红菇多糖具有一定的抗肿瘤活性，但对于红菇的其它活性成分抗肿瘤的效果很少报道，机理也不甚清楚[2-4]。本文以MDA-MB-231（乳腺癌细胞）、Hela(子宫颈癌细胞)细胞为干预模型，观察和分析用石油醚、乙酸乙酯、乙醇和蒸馏水提取的活性物质对肿瘤细胞活力的影响，以期发现一种新的抗肿瘤的方法。
二 材料与方法
（一）材料与试剂
红菇：产地福建，购于南靖土楼；MDA-MB-231乳腺癌细胞株、Hela子宫颈癌细胞株：中国科学院细胞库；高糖DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶（含EDTA含酚红）：Life technology；二甲基亚砜DMSO、四甲基偶氮唑盐（MTT）：美国Sigma公司；石油醚、乙醇、乙酸乙酯等试剂均为国产分析纯；水为蒸馏水。
（二）仪器与设备
T-214电子天平：美国DENVER；北京赛多利斯仪器有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培养箱和MLS-3750灭菌锅：日本SANYO；TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；移液器：德国Eppendorf；酶标仪（Bio-Rad iMark美国）、TS-100荧光倒置显微镜：日本NIKON；HAO-100A手提式高速粉碎机、DF-101SS集热式恒温加热磁力搅拌器。
（三）实验方法
1.红菇不同溶剂提取方法
（1）红菇不同溶剂提取工艺流程：
红菇干实体→冲洗、干燥→粉碎→加石油醚提取→抽滤→真空浓缩→浸膏干燥→石油醚提取物。
滤渣1→干燥→加乙酸乙酯提取→抽滤→真空浓缩→浸膏干燥→乙酸乙酯提取物。
滤渣2→干燥→加乙醇提取→抽滤→真空浓缩→浸膏干燥→乙醇提取物。
滤渣3→干燥→加蒸馏水提取→抽滤→真空浓缩→浸膏干燥→水提取物。
（2）红菇不同溶剂提取操作方法
将红菇子实体流水冲洗去泥沙，60℃烘干至恒重，粉碎成粉末，称取红菇粉50.0g溶解于500mL石油醚中，配料比为1：10，用DF-101SS集热式恒温加热磁力搅拌器在80°C浸提2h，真空抽滤，得到的石油醚溶液进行减压浓缩，将得到的粘稠膏进行干燥，得到石油醚提取物。滤渣干燥后在同样的条件下依次加入乙酸乙酯、乙醇、蒸馏水进行提取、减压浓缩、干燥，分别得到乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提取物。
2.细胞培养
准备38-40℃的温水，将配好的培养基（90%高糖DMEM、10%胎牛血清）放在培养箱中恒温10min。将冻存的MDA-MB-231细胞放入温水中在一分钟内解冻，加入10倍的培养基，放在37℃、5%CO2的条件下培养，16-20h后进行观察，根据情况进行换液，换掉一半的培养基，或者消化，吸去旧培养基，加入1mLPBS缓冲液洗两次，加入1mL0.25%胰酶进行消化，适度后用移液枪进行吹打，使细胞均匀的分散开，加培养基1ml,继续吹打，离心5 min(1000r/min)[5]。根据需要将细胞分别接到培养瓶和96孔板中，进一步培养。采用相同的方法对Hela细胞进行培养。
3.MTT法检测提取物对肿瘤细胞活力的抑制效果
（1）分别称取100mg石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水提取物，使其溶解于DMSO中，配制成浓度为100mg/mL的原液。
（2）分别取一定量的原液放到配制好的培养基中，分别稀释成一系列浓度：10、20、40、60、80、100、140、180、200、300、400、500μg/mL，用于检测提取物对MDA-MB-231细胞的抑制效果。而用于检测对Hela细胞抑制效果的提取物原液则分别被稀释成100、150、200、400、600、800μg/mL。将不同浓度的提取物根据情况依次按100μL/孔接种到细胞汇合度60%-70%的96孔板中，每个浓度做三个平行，同时每个浓度做空白对照。然后放于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
（3）在培养箱培养12-24 h，在倒置显微镜下观察、拍照。丢掉旧的培养液，在避光的条件下每孔加入100μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，将96孔板置于37℃CO2培养箱中培养4h，然后弃去上层溶液，每孔加入100μL的DMSO，用酶标仪在490 nm处测量吸光值，可间接反映活细胞数量，并计算出细胞活力抑制率（%）：细胞活力抑制率（%）=（1-试验组OD值/正常组OD值）×100%[6]。测定一式三份。
三 结果与分析
（一）红菇不同溶剂提取物对MDA-MB-231细胞活力的影响
从表1可以看出，红菇的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和乙醇提取物均对MDA-MB-231细胞有明显的抑制作用，抑制作用随浓度的增大而增大，并趋于稳定，特别是乙酸乙酯提取物在400、500μg/mL时影响效果更明显，抑制率达到了90%以上。水提取物的抑制作用不明显。
（二）红菇不同溶剂提取物对Hela细胞活力的影响
从表2可以看出，红菇的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和乙醇提取物均对Hela细胞有较明显的抑制作用，抑制作用随浓度的增大而增大，并趋于稳定，水提取物的抑制作用不明显。MDA-MB-21细胞对于提取物的作用比Hela更为敏感。
（三）细胞的形态学观察
将培养好的MDA-MB-231细胞加入100μg/mL乙醇提取物，培养12-24 h发现乙醇提取物对MDA-MB-231细胞活力有很强的抑制性，而对照组的细胞几乎是完整的。在荧光倒置显微镜下观察空白对照组细胞和加入乙醇提取物的细胞的形态，结果如图1所示，图a表示空白对照组细胞的形态，细胞贴壁生长，大多数成梭形并且透明度高，有少部分细胞死亡成圆形，细胞生长的比较饱满，分裂正常。图b表明，在100μg/mL浓度下，加入乙醇提取物的细胞表现出明显的死亡特征，总体细胞固缩变圆，部分细胞体积变小，甚至有少部分细胞脱落漂浮于培养基中，细胞的密集度降低，而且随着培养物浓度的增大，时间的增长，这种现象也更加明显。
四结论
以红菇为原料，用MTT法检测石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水提取物对MDA-MB-231、Hela细胞的细胞活力的抑制作用，用倒置荧光显微镜观察。结果可以看出石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物对MDA-MB-231、Hela细胞都有抑制作用，且在一定浓度范围内随浓度增大抑制程度也增大。特别是石油醚提取物在浓度为140μg/mL时，对于MDA-MB-231细胞的抑制率就达到了51.16%，而乙醇提取物在浓度为100μg/mL时，对于MDA-MB-231细胞的抑制率达到了55.39。乙酸乙酯提取物在400、500μg/mL时影响效果更明显，抑制率达到了90%以上。水提取物的抑制作用不明显。
红菇用石油醚、乙酸乙酯和乙醇提取的活性物质对MDA-MB-231、Hela细胞的凋亡有促进作用可以看出，红菇具有一定的抗肿瘤作用，可以用于后续的抗癌药物研发。
参考文献
[1]王青云,石木标.中国红菇的研究现状与展望[J].中国食用菌,2004(04):10-12.
[2]张云波,夏爱军,梁园等.红菇的药理作用研究进展[J].中国药业,2013,22(2):95-96.
[3]李金灿,陆辉,张相日.食用菌多糖特性与保健作用研究新进展[J].中国食用菌,2005，24(6):7-11.
[4]赵国华,陈宗道,李志孝等.活性多糖的研究进展[J].食品与发酵工业,2001,27(7):45-48.
[5]陈旭健,甘耀坤,吴慧慧等.红菇子实体对小鼠血糖、血脂的影响[J].食品科技,2008(04):237-239.
[6]曾庆华,叶勇,刘坤等.长根静灰球活性物质提取及体外抗肿瘤作用研究[J].天然产物研究与开发,2018,30(01):102-108.
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