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摘要：药用植物生理生态学是中药资源与开发专业的专业基础课，是一门理论与实验教学相结合的课程。本文从该门课程的性质、专业特点的角度出发，针对该课程中的实验内容之一“叶绿素提取、含量、理化性质测定”中存在的问题进行探讨与分析。结合教学体会和经验就如何利用互动式教学方法，来提高实验原理的讲授效果进行了阐述。对实验结果的观察分析和实验操作过程中容易出现问题的地方提出改进建议，望对该课程的实验教学有所帮助。
关键词：药用植物；生理生态；叶绿素；实验教学
本文引用格式：吴廷娟，等.药用植物叶绿素提取、含量、理化性质测定实验方法的探讨与改进[J].教育现代化,2019,6(18):167-168.
《药用植物生理生态学》是我校中药资源与开发专业本科班的一门基础专业课，在该专业的学习过程中起到承前启后的作用。通过与前期《药用植物学》的学习使学生掌握药用植物生长发育过程中的基本生理现象及其与环境的关系，为将来《药用植物栽培学》和《中药资源学》的学习提供理论基础知识[1]。本课程主要由理论授课和实验教学相结合来完成教学大纲任务。根据该课程教学大纲，本课程共开设4个实验内容，其中之一就是叶绿素的提取、含量与理化性质的测定。通过该实验，来验证叶绿素在理论上一些理化现象，使学生加深对叶绿素理化性质的理论认识。由于本课程为该专业的新开课程，在该实验准备和操作方面存在许多不足，导致每次实验不能够顺利完成，或完成的质量不高。作者通过几年的实验摸索和亲身教学体会，对实验过程中容易出现的几个问题进行了分析思考，并提出一些建议，望能为以后的实验教学提供指导。
第一，学生对理论知识掌握的不扎实，对实验原理理解的不透彻。由于受学时的限制，理论课老师对叶绿素的理化性质相关知识点的讲解可能不深入，不全面。实验时如果实验老师不加以补充的话，学生就可能对一些实验原理一知半解，也就不能对实验结果进行准确判断和分析。比如，叶绿素在提取过程中用到的提取溶剂是含水的有机溶剂，如果实验老师不把叶绿素的化学结构式进行详细的讲解，学生可能会有疑问或不清楚为什么必须用含水的有机溶剂，而不是用蒸馏水或纯的有机溶剂来提取叶绿素。另外，教材上对叶绿素溶液的荧光现象、取代反应、皂化分层现象等都是稍有提到，对具体的实验原理和现象都解释的不深入，都需要实验老师在试验开始前进行进一步详细的讲解。
对于叶绿素溶液荧光现象的观察，实验老师要结合实验原理的讲解，提前准备分离好的叶绿素提取溶液在课堂上展示荧光现象是如何形成的。通过老师的讲解和操作，让学生明白为什么绿色的叶片产生的荧光比较弱，我们肉眼不容易观察到，而叶绿素提取溶液的荧光比较强，肉眼能够观察到而且荧光是红色的。同时，由于荧光的强弱受溶液的浓度，光的亮度以及观察角度的影响，所以实验时学生有时候观察不到荧光，或者荧光很微弱，并不像书上所讲的很亮的远红光。所以，我们在观察时要选择未稀释的叶绿素提取溶液，并让光源贴近溶液，从不同的角度来观察比较，从而寻找最佳的观察角度。我们背对光源观察时，身体可以稍微斜一点，即与光源保持一定的角度。另外还可以在光源的对面即叶绿素溶液的另一面放置一张白纸来增强荧光。
对于研磨过程中为什么要加入少量碳酸钙粉末的重要性也需要老师进行讲解和强调，否则学生不够重视，认为加与不加都行，导致会有少数学生不加。如果不加碳酸钙就会造成部分叶绿素损失，导致最终所测得的叶绿素含量不准确。对于加入碳酸钙的数量也要强调不能过多或过少。如果过多，会造成叶绿素提取溶液呈碱性，造成观察皂化分层现象时出现乳化现象，如果过少，叶绿素提取不充分，成叶绿素浓度过低。
第二，实验操作过程中，实验材料、玻璃仪器的准备也很重要。由于我校为中医药大学，结实实际，实验时要选择一些容易采到的常见药用植物叶片为材料，比如地黄、白芷、菊花等。所以在近两年的实验中我们选择地黄代替常用的菠菜作为该实验的实验材料。实验过程中，参考张志良《植物生理学实验指导》书上的叶绿素提取方法[2]。称取叶片2-3g，提取叶绿素时用的是25ml的棕色容量瓶，配套使用的是小漏斗。实际实验操作过程中发现，由于漏斗小、材料多，造成过滤时间过长，从研磨到过滤完成大概需要1.5h，这就严重影响整个实验的进度和效率。另外，由于实验过程叶绿素容易被光破坏，所以研磨或过滤时间过长也影响后续理化性质的观察和测定。针对此问题，通过实验比较，我们发现取材1g左右，用大漏斗先过滤到孔口比较的试管中，然后再定容到25ml棕色容量瓶中比较容易过滤，节约大量时间。另外，选择使用较小规格的研钵和研棒，可以减少研磨和过滤过程中叶绿素的损失。针对此问题，实验老师也正在尝试用其它的叶绿素提取方法来代替传统的叶绿素提取方法，如叶绿素的热醇快速提取法[3]、叶片细丝浸泡法[4]等。
第三，测定叶绿素含量时，我们使用的是分光光度计法。根据光合色素提取液对可见光谱的吸收特性，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算需提取液中各色素的含量。测量前一定要先稀释，否则易超过分光光度计的测定范围。可以根据提取液的浓度来确定几个稀释倍数后，选择一个最佳的稀释倍数后再测定光合色素的含量。根据我们的实验结果，一般选择稀释10-50倍比较好，具体的稀释倍数还要根据材料的种类、取材量来定。由于叶绿素a和类胡萝卜素在蓝光区都有吸收峰，所以在测定叶绿素a和b时为了排除类胡萝卜素的干扰，应选择叶绿素在红光区单色波长的最大吸收峰。因此，测定时要依据实验内容是要获得叶绿素的含量，还是要获得光合色素的含量来进行吸收光谱的选择。另外，测定时由于多组学生共用一套比色杯，每组学生测定前必须把比色杯冲洗干净，并用吸水纸吸干水分后再测定。最后，每组学生最好重复测量几次，用平均值来计算叶绿素的含量。
第四，为培养学生严谨认真的科学态度以及发现问题、分析问题、解决问题以及科学探究的能力，可以尝试进行以学生为主导地位的“互动式”[3]或“学导式”[4]的实验教学方法，或结合多种教学手段，提高学生参与实验的积极性和主动性[5]，提高教学效果。例如，为更好的向学生解释为什么用含少量水分的有机溶剂来提取叶绿素，可以在让学生动手设计一个对比实验。分别用纯水、100%乙醇和95%的乙醇来提取叶绿素，让学生观察比较实验结果有什么不同，结合老师的解释，就能很好的理解实验原理了。这样不仅能提高教学效果，还增加了学生参与实验的乐趣和积极性。另外老师可以留一些思考题，如让学生思考叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析。
最后，作者对实验操作过程提出几点注意事项：1）每组需要的玻璃试管、仪器较多，操作时要需多加小心；2）所有实验过程尽量在弱光下进行；3）过滤时，先用提取试剂湿润一下滤纸，并先过滤上清液，后过滤残渣，可以加速过滤和减少叶绿素的损失；4）叶绿素的过滤液不能浑浊，可在710nm和750nm处测量吸光度，其吸光度应小于在665nm处的吸光度的5%，否则应重新过滤；5）做取代反应时，应用胶头滴管缓慢加入试剂，并边加边摇，仔细观察溶液的变化；6）计算叶绿素含量时单位为mg/g，而浓度为ml/L，要注意单位间的换算。
参考文献
[1]黄璐琦,王康才.药用植物生理生态学[M].第1版.北京：中国中医药出版社,2012
[2]张志良,翟伟菁.植物生理学实验指导[M].第3版.北京：高等教育出版社,2002
[3]冯瑞云.叶绿素的热醇快速提取法[J].江苏农业学院学报,1985,6（3）:53-54.
[4]舒展,张晓素,陈娟等.叶绿素含量的简化[J].植物生理学通讯,2010,46（4）:399-402.
[5]李志丹,韩瑞宏,廖桂兰,等.植物叶片中叶绿素提取方法的比较研究[J].广东第二师范学院学报,2011,31(03):80-83.
[6]池春玉,杨守志,赵丽杰,等.“学导式”教学法在植物生理实验课教学中的应用[J].生物学通报,1999(07):38-39.
[7]吴廷娟,谢小龙.《药用植物生理生态学》课程教学体会[J].中国民族民间医药,2017,26(4):131-132.
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