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摘要：目的分析半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖能力的影响。方法利用绘制细胞生长曲线的方法，观察半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖能力有哪方面的影响；通过蛋白质印迹法来观察半枝莲对淋巴管内皮细胞中VEGFR-3以及HGF蛋白表达有哪方面的影响。结果随着半枝莲药物浓度升高，淋巴管内皮细胞的抑制率也随着上升；VEGFR-3以及HGF蛋白情况下调明显（P<0.05）。结论应用半枝莲能明显抑制淋巴管内皮细胞的增殖能力，对VEGFR-3以及HGF蛋白具有下调的作用，对VEGFR-3信号通路影响可能为抑制肿瘤淋巴道转移机制之一。
关键词：半枝莲；淋巴管内皮细胞；增殖能力；VEGFR-3
本文引用格式：姚施宇,李明秋,张大伟,等.半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖能力的影响[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(97):188,194.
0引言
根据大量临床资料得知，很多肿瘤在早期都会实现向淋巴的转移，因此对该转移渠道进行一定程度的干预，能够对肿瘤转移早期治疗起到很大的帮助。然而就当前临床治疗形势来看，并没有明确的抑制淋巴道转移的药物。有专家学者认为，经肿瘤诱导的淋巴管生成是肿瘤向淋巴道发生转移中最重要的一个环节，而肿瘤淋巴管的生成则需要肿瘤细胞和淋巴管内皮细胞相互发生作用[1-2]。在互相作用的过程中，肿瘤细胞会表达出很多淋巴管生成的因子，和肿瘤内部以及周围淋巴管内皮细胞受体互相发生作用，将淋巴管内皮细胞信号传导通路激活。半枝莲为中药种类之一，性寒味苦，对肿瘤起到一定的抑制作用[3-4]。本文试图探讨半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖能力的影响，归纳总结可能的分子机制。
1资料与方法
1.1一般资料
本次研究所需要的主要材料为：①半枝莲：南通三越重要饮片有限公司生产，经80%乙醇减压浓缩制备成1 g/mL的浓缩液；②淋巴管内皮细胞：采购于上海丽臣商贸有限公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养
将淋巴管内皮细胞经过常规复苏后，接种在10%新生牛血清的低糖IMDM培养液当中，放置在温度为37℃、二氧化碳体积分数在5%的培养箱中进行培养。取对数生长期细胞，并使用0.25%的胰蛋白酶进行消化处理，行细胞计数。
1.2.2细胞增殖实验
①取孔径为0.4μm的6孔培养板小室，将淋巴管内皮细胞消化制成细胞悬液，将细胞数调整到1×104/mL，分别接种1 mL在下室内，并将其在二氧化碳体积分数在5%和37℃的保温箱中进行培养；②12 h之后，根据实验分组所体现的不同要求，分别接种不同浓度的半枝莲注射液在上室（浓度为0.42μm/mL、0.21μm/mL和0.105μm/mL），随后设立空白对照，放在保温箱中一同培养；③在实验当中每组分别设置6个时间平行孔，在每个时间点另设3个复孔。每间隔1 d，连续6 d对下室的淋巴管内皮细胞进行台盼蓝染色；④对每个样本随机选取5个视野来计数，记录号不同时间点的平均细胞数；⑤将培养时间设定为横坐标，平均细胞数设定为纵坐标，以此绘制出细胞生长曲线[5]。本次试验重复3次。
1.2.3蛋白质印迹法检测VEGFR-3以及HGF蛋白表达
处于对数生长期的淋巴管内皮细胞消化传代，将其均匀接种在4个25 cm2的培养瓶当中，并设立对照组和观察组（半枝莲浓度分别为0.42μm/mL、0.21μm/mL和0.105μm/mL），对其进行24 h培养之后，收集好细胞，利用常规方法测定出总蛋白的含量。SDS-PAGE电泳，分离胶浓度设立为8%，每孔上样50μg。电泳后经电转移到PVDF膜上，经室温封闭1 h。根据合适的比例增加一抗4℃摇床过夜，PBST洗膜3次，使用辣根酶标记过的抗体PBST溶液37℃温育1 h，PBST洗膜3次。最后一步为ECL试剂反应显色，利用X线胶片曝光1~5 min后显影，使用胶片晾干、扫描、成像[6]。完成后使用Image-J软件对图像进行分析，该实验同样重复3次。
1.3统计学方法
将本次研究所得出的数据依次输入到SPSS 18.0软件中进行统计学分析，用（±s）来表示计量资料，采用t检验，当P<0.05时所得结果有统计学意义。
2结果
2.1半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖的影响
利用绘制细胞生长曲线的方法，观察半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖能力有哪方面的影响。实验结果显示，随着半枝莲药物浓度升高，淋巴管内皮细胞的抑制率也随着上升，淋巴管内皮细胞增殖速度减缓。说明半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖具有很大程度的抑制作用（P<0.05），详细数据见图1。
2.2半枝莲对淋巴管内皮细胞中VEGFR-3以及HGF蛋白表达的影响
半枝莲给药浓度越高，淋巴管内皮细胞中VEGFR-3以及HGF蛋白表达就越低。在给药0.21μm/mL和0.105μm/mL后，VEGFR-3蛋白和β-actin蛋白条带光密度比值为（0.44±0.18）（0.62±0.11）（0.80±1.10），明显低于对照组的（1.03±0.02）（P<0.05）；HGF蛋白和β-actin蛋白条带光密度比值为（0.29±0.02）（0.53±0.01）和（0.76±0.09），明显低于对照组的（0.95±0.02）（P<0.05），说明半枝莲对VEGFR-3以及HGF蛋白具有下调的作用，对VEGFR-3信号通路影响可能为抑制肿瘤淋巴道转移机制之一。
3讨论
随着医学工作者对淋巴管内皮细胞方面的研究不断加深，肿瘤向淋巴转移方面的研究也取得了长足的进展[7]。根据现阶段的研究可以证实，经肿瘤诱导的淋巴管生成是肿瘤向淋巴道发生转移中最重要的一个环节，而肿瘤淋巴管的生成则需要肿瘤细胞和淋巴管内皮细胞相互发生作用[8]。在互相作用的过程中，肿瘤细胞会表达出很多淋巴管生成的因子，和肿瘤内部以及周围淋巴管内皮细胞受体互相发生作用，将淋巴管内皮细胞信号传导通路激活。而半枝莲为中药种类之一，性寒味苦，对肿瘤起到一定的抑制作用。
通过本次研究结果可以得知，利用绘制细胞生长曲线的方法，观察半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖能力有哪方面的影响。实验结果显示，随着半枝莲药物浓度升高，淋巴管内皮细胞的抑制率也随着上升，淋巴管内皮细胞增殖速度减缓。说明半枝莲对淋巴管内皮细胞增殖具有很大程度的抑制作用；而半枝莲给药浓度越高，淋巴管内皮细胞中VEGFR-3以及HGF蛋白表达就越低。在给药0.21μm/mL和0.105μm/mL后，VEGFR-3蛋白和β-actin蛋白条带光密度比值为（0.44±0.18）（0.62±0.11）（0.80±1.10），明显低于对照组的（1.03±0.02）（P<0.05）；HGF蛋白和β-actin蛋白条带光密度比值为（0.29±0.02）（0.53±0.01）和（0.76±0.09），明显低于对照组的（0.95±0.02）（P<0.05），说明半枝莲对VEGFR-3以及HGF蛋白具有下调的作用，对VEGFR-3信号通路影响可能为抑制肿瘤淋巴道转移机制之一。
综上所述，应用半枝莲能明显抑制淋巴管内皮细胞的增殖能力，对VEGFR-3以及HGF蛋白具有下调的作用。
参考文献
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