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摘要：目的应用DNA条形码技术准确、快速鉴定蒙药材甘草。方法采用试剂盒法提取药材的基因组DNA，PCR扩增其核糖体DNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer 2，ITS2）并进行双向测序，应用CodonCode Aligner17.0对测序峰图进行校对拼接，比较ITS2序列的GC含量，采用MEGA 5.0计算种内遗传距离，并得到峰图和二级结构。结果甘草药材的ITS2序列长度为223 bp，种内无变异，平均K2P遗传距离为0，GC含量53%，建立其二级结构和峰图。结论ITS2基因序列可以鉴定蒙药材甘草，为该蒙药的分子鉴定提供方法。
关键词：甘草；ITS2序列；DNA条形码；分子鉴定
本文引用格式：包同力嘎,图雅,撒切尔,等.基于ITS2序列蒙药甘草DNA分子鉴定研究[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(100):177+181.
0引言
蒙药材甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）的干燥根及根茎[1]，主要分布于内蒙古、新疆、甘肃、陕西、山西、青海、宁夏等地。别名为“兴阿日”或西和日·额布苏。具有止咳祛痰，止渴，滋补，清热，止吐，解毒之功效；主要用于肺热，哮喘，咳嗽，肺脓疡，舌咽发干，口渴，咽喉干痛，恶心恶吐，白脉病，身体虚弱等症。蒙药材鉴定方法目前主要为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。而近年来，分子生物技术在植物研究中的广泛应用，使操作方法简单、鉴定准确性高的DNA条形码鉴定技术逐渐成为一种新的有效鉴定方。ITS2序列为植物核糖体DNA中的内转录间隔区2片段，具有进化速率快、变异程度高、区分物种能力强的特点，可以作为药用植物与近缘种分子鉴定的通用条形码序列。本研究通过对甘草样本的ITS2片段进行用DNA条形码分析，对甘草进行准确鉴定。
1仪器与材料
JY200C型电泳仪、JY-SPC型电泳槽、Multigene Gradient PCR仪、QUANTUM凝胶成像系统、SIGMA 3K15高速冷冻离心机、明澈-D超纯水机；ECLIPSE E100显微成像系统；离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒、Taq聚合酶、Master Mix（Dye），ITS2引物、Trans5k DNA Marker、琼脂糖、其余试剂均为分析纯；本实验用甘草经内蒙古民族大学包桂花教授鉴定为（Glycyrrhiza uralensis Fisch）。
2方法与结果
2.1ITS2序列测定。根据文献[2-4]选择引物进行ITS2序列扩增，正向引物ITS2F5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’反向ITS3R5‘GACGCTTCTCCAGACTACCAAT-3’，委托上海生工生物工程有限公司进行合成。
2.2总DNA提取。使用植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN）提取总DNA，将药材用硅胶干燥，用研钵研碎，取粉末约30mg，按照试剂盒说明书完成对总DNA的提取[5-6]。
2.3PCR扩增及电泳检测。PCR反应总体积50.0μL，包含2×Es Taq MasterMix 25μL，引物各2.0μL（2.5μmol/L），ddH2O 17μL，总DNA 4.0μL。扩增条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30s，72℃延伸45s（进行40个循环），72℃延伸10 min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测其PCR产物检测结果见图1[7-8]，由北京华大基因研究中心纯化及测序。
2.4数据处理。测序后所得序列分别利用MEGA 7.0软件处理，去除引物及两侧低质量区，获得碱基序列和峰图以及相应的二级结构图。结果见图2-4。
3结论
本实验对甘草的ITS2序列进行分析，结果显示甘草ITS2序列的种内K2P遗传距为0，通过二级结构可以与其它近缘种植物区分开。因此，ITS2序列可以作为鉴定甘草的DNA条形码序列。本研究利用ITS2序列实现了对甘草的准确鉴定，该结论对蒙药甘草的分子鉴定研究及中药资源开发利用具有重要的意义。
参考文献
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