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摘 要：目的 建立 HPLC 法测定注射用复方甘草酸苷中甘氨酸与盐酸半胱氨酸的含量。方法 采用 Agela -C18 色谱柱；甲醇—硫酸铵溶液（5:95）为流动相；检测波长为 205 nm。结果 甘氨酸进样量在 4.056-202.80 µg 范围内与峰面积呈良好线性关系，回收率为 99.1%，RSD=0.3%（n =9）；盐酸半胱氨酸进样量在 0.2066-10.33 µg 范围内与峰面积呈良好线性关系，回收率为 98.7%，RSD=0.5%（n =9）。结论 该方法简便可靠，专属性强，重现性好，可用于注射用复方甘草酸苷的质量控制。
关键词： 甘氨酸；盐酸半胱氨酸；高效液相色谱法
本文引用格式：汝秋明, 王佳楠 .HPLC 法测定注射用复方甘草酸苷中两种氨基酸的含量 [J]. 世界最新医学信息文摘,2018,18(70):85+161.
0引言
注射用复方甘草酸苷为我所国家评价性抽验的该注射剂系列品种之一，是由甘草酸苷、甘氨酸与盐酸半胱氨酸等组成的复方制剂，主要用于湿疹、皮肤炎、荨麻疹、慢性肝病， 改善肝功能异常等的治疗[1-2]。该品种涉及 8 家企业注册标准， 采用柱前衍生化法或容量分析法测定两种氨基酸的含量，方法操作繁琐，受影响因素较多，测定结果误差较大。通过试验研究，采用液相色谱法直接测定，该方法简单易行，重现性好，能更好控制该品种的质量。
1仪器与试药
Agilent 1200 高效相色谱仪。甘氨酸对照品与盐酸半胱氨酸对照品均购自中国药品生物制品检定院（批号：140689- 201103，140699-201001，含量均为 100%），注射用复方甘草酸苷为 8 家生产企业样品。甲醇为色谱纯，硫酸铵、庚烷磺酸钠、盐酸为分析纯，水为超纯水。
2色谱条件与系统适用性试验
采用 Agela C18 （250 mm×4.6 mm，5 µm）色谱 柱，以甲醇—硫酸铵溶液（硫酸铵 2.25 g，庚烷磺酸钠 1.82 g，加水 500 mL 溶解，用 5mol·L-1 盐酸溶液调节 pH 值至2.5）（5:95）为流动相；检测波长为 205 nm。流速：0.8 ml·min-1，柱温 35℃，进样量：20 µl，理论板数按盐酸半胱氨酸峰计算应不低于 3000，甘氨酸峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
3溶液的制备
3.1对照品溶液。精密称取甘氨酸和盐酸半胱氨酸对照品适量，用水溶解并稀释制成每 1 mL 含甘氨酸和盐酸半胱氨酸分别为 2 mg 和 0.1 mg 的溶液，即得。
3.2供试品溶液。精密称取装量差异项下细粉适量，用水制成每 1 mL 含甘氨酸 2 mg 的溶液，即得。
3.3阴性对照溶液。按处方比例配制不含甘氨酸和盐酸半胱氨酸的阴性样品，按“3.2”项下方法制备阴性对照溶液。结
果色谱图中未检出与对照品溶液两个主峰保留时间一致的色谱峰，见图 1-3。
4方法与结果
4.1线性关系。取甘氨酸与盐酸半胱氨酸对照品适量，加水制成每 1 mL 中含甘氨酸 4.056 mg 与盐酸半胱氨酸 0.2066mg 的溶液，精密量取 1、5、10、20、50 µl 分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量（µg) 与峰面积计算回归方程， 分别为甘氨酸 Y=5669369X-77.3 r=0.9999；盐酸半胱氨酸Y=6035898X -106.2 r=0.9998。结果表明甘氨酸与盐酸半胱氨酸进样量分别在 4.056-202.80 µg 与 0.2066-10.33 µg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。
4.2重复性试验。取样品，按“3.2”项下方法，制备供试品溶液 6 份，分别测定。结果甘氨酸与盐酸半胱氨酸的含量分别为 104.3%，RSD 为 0.3% 与 97.2%，RSD 为 0.6%。
4.3精密度试验。取供试品溶液 20 µl，连续进样 6 次，记录色谱图，结果甘氨酸与盐酸半胱氨酸峰面积 RSD 分别为
0.6% 与 0.7%。
4.4稳定性考察。取供试品溶液每隔 2 小时进样 1 次，记录色谱图，甘氨酸和盐酸半胱氨酸峰面积 RSD 分别为 0.6% 与0.7%（n =7），结果表明供试品溶液在 12 小时内稳定。
4.5准确度试验。精密称取甘氨酸原料 160 mg、200 mg、240 mg 与盐酸半胱氨酸原料 8 mg、10 mg、12 mg，各三份， 分别置已加入阴性对照的 100 mL 量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，滤过，精密量取续滤液 20 µl 分别注入液相色谱仪，计算回收率。甘氨酸回收率为 99.1%，RSD=0.3%（n =9）；盐酸半胱氨酸回收率为 98.7%，RSD=0.5%（n =9）。
4.6样品测定。按上述方法测定 8 家企业样品中的甘氨酸和盐酸半胱酸的含量，结果甘氨酸与相邻辅料峰均能完全分离， 两种氨基酸含量测定结果重现性好，专属性强。
5讨论
5.1检测波长确定。甘氨酸与盐酸半胱氨酸紫外均为末端吸收，故选择检测波长为 205 nm。
5.2六家企业现行标准的甘氨酸与盐酸半胱氨酸含量测定采用容量分析法。该法测定甘氨酸终点突跃不明显，盐酸半胱氨酸的空白辅料使测定结果偏高约 4.5%，导致两成分的测定结果误差较大。
5.3测定方法的选择 HPLC 法测定氨基酸多为柱前衍生化法 [3]，该方法操作繁琐，且衍生化试剂毒性大；部分方法采用强酸性离子交换树脂为填充剂色谱柱测定 [4]，该色谱柱成本高，耐用性差；及采用蒸发光检测器测定氨基酸的含量 [5]， 均不是最佳选择。故参考乙酰半胱氨酸颗粒中色谱条件 [6]， 通过试验建立上述测定方法，该法操作简便，重复性好，可作为该品种的含量测定方法。
参考文献：
[1]沈宝贤，曾运繁，林羽，等. 复方甘草酸苷治疗慢性湿疹临床疗效观察［J］. 中国社区医师（医学专业），2011.13（36）：183-184.
[2]王争胜. 复方甘草酸苷治疗过敏性哮喘临床观察［J］. 中国社区医师（医学专业），2010.12（14）：52.
[3]曹玲，张云楚 . 柱前衍生化 HPLC 法同时测定注射用复方甘草酸苷中盐酸半胱氨酸和甘氨酸的含量［J］. 中国药品标准，2007,8(5)： 31-33.
[4]刘甲. 李薇.HPLC 法测定复方甘草酸苷注射液中甘氨酸及盐酸半胱氨酸的含量［J］. 亚太传统医药，2009,5（7)：23-24.
[5]张建业. 冯向东.HPLC-ELSD 测定复方甘草酸苷注射液中 2 种氨基酸的含量［J］. 中国实验方剂学杂志，2013,19（14)：161-163.
[6]中华人民共和国国家药典委员会. 中华人民共和国药典［M］. 北京： 中国医药科技出版社，2015,7-8.
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