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摘要：糖尿病肾病（diabetic neprophthy DN）目前被认为是免疫参与的炎症性疾病，炎症反应贯穿于糖尿病肾病的全过程，部分免疫抑制剂也已应用于糖尿病肾病的临床研究中。细胞焦亡是近年发现的一种特殊炎症性的细胞死亡模式，由NLRP3(NOD-like receptor pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎症小体调控、半胱氨酸蛋白酶(cysteiny-l aspartate specific protease,caspase-1)介导、GSDMD参与的信号通路。高糖、氧化应激、脂代谢紊乱、晚期糖基化产物等均可激活细胞诱发细胞发生焦亡，促进疾病进展。本文对NLRP3炎症小体、Caspase-1、GSDMD及在DN研究中进行阐述，为临床研究提供方向。
关键词：细胞焦亡；糖尿病肾病；Caspase-1；NLRP3炎症小体；GSDMD
本文引用格式：李会芳.细胞焦亡与糖尿病肾病研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2019,19(71):82-83,88.
0引言
目前认为，DN由多种炎症因子介导的代谢性疾病，高糖、脂代谢紊乱、氧化应激、晚期糖基化产物等多种因素贯穿于DN全过程。目前研究证实：这些危险因素同时与细胞焦亡发生密切相关，细胞焦亡与糖尿病肾病之间的关系越来越受到重视。细胞焦亡（pyroptosis）：是一些免疫活性细胞在病原体及对机体危险信号的刺激下，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）激活，诱导细胞发生的一种新的程序性死亡现象[1]。细胞焦亡具有凋亡和坏死的双重特征：细胞核皱缩，DNA断裂及染色阳性、细胞肿胀炸裂、并引起炎性反应。于1992年Zychlinsky等研究发现福氏志贺菌使感染的巨噬细胞发生程序性死亡，因其与凋亡有些共同的特征，当时被认为是凋亡。2001年,Cookson等[2]首次以“细胞焦亡”来命名这种依赖于Caspase-1的程序性细胞死亡方式。细胞焦亡以激活Caspase-1为核心，形成NLRP3炎性小体、通过GSDMD介导，迅速引起细胞膜破裂、细胞内容物释放引起炎症反应；细胞焦亡的典型表现为细胞内炎性小体NLＲP3表达上升，活性caspase-1水平增加及IL-1和TNFα等促炎症因子的大量表达，其鉴定标准为caspase-1表达和PI染色的双阳性。
细胞焦亡是近年来生命科学研究的热点，具有天然免疫炎症的特殊性，目前研究细胞焦亡参与了阿尔兹海默症、帕金森等神经系退行性疾病中、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、糖尿病肾病等慢性进行性疾病中。研究证实：多种危险相关分子（如高血糖、脂肪酸、氧化应激、晚期糖基化产物等），可被细胞内相关的模式识别受体PRRs（pattern recognitionreceptors，PRRs）所识别，诱发细胞焦亡的发生，导致细胞损伤，功能下降[3]。抑制炎性因子表达和调控细胞焦亡通路有可能成为防治糖尿病及一些慢性病的新策略。本文对目前细胞焦亡关键环节：NLRP3炎症小体表达增加、Caspase-1激活及GSDMD介导细胞焦亡及在DN相关研究进行综述。
1炎症小体
炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)以及pro-caspase-1组成的复合体[4]；NLRP3是胞浆内PRRs参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分，分布于单核细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞、胶质细胞、树突状细胞、上皮细胞等，具有识别病原体的功能。
研究发现可介导细胞焦亡的炎性小体有NLRP3、NLRP1、NLRC4、AIM2和TLR4等[5]。其中NLRP3炎性小体是炎症反应的核心因子，是固有免疫细胞内的危险信号感受器之一，目前研究最为广泛和全面，NLRP3蛋白由LRR、NACHT及CARD或PYD3部分组成[6]。NLRs受到各种外界或是细胞内外的危险信号后，NACHT活化发生寡聚化，NLRP3则相应的通过其氨基端的PYD与ASC的蛋白结构域PYD(pyrin domain,PYD)结合；同时其ASC的CARD和Caspase-l的caspase-CARD(caspase-activating and recruitment domain,CARD)结构域结合，以此形成NLRP3炎性体从而激活Caspase-1[7]。活化的caspase-1可以自身切割活化并促使细胞白介素和其他细胞因子的成熟。细胞感受外界各种刺激以使细胞Caspase-1活化的过程，需要NLRP3炎症体的调控。相关研究表明，其作为细胞胞浆内重要的PRRs，可感知胞内病原微生物及其代谢产物，在机体免疫反应和炎症反应的过程中具有非常重要的调控作用。细胞焦亡依赖于Caspase-1的炎症性细胞程序性死亡模式，体内外多种刺激信号通过不同途径激活Caspase-1，进而使细胞发生不同于凋亡的焦亡；炎性体的激活活化是细胞焦亡发生的关键，而NLRP3炎性体是炎症反应的核心，故而NLRP3炎性体与细胞焦亡的发生具有密切关系。
NLRP3:NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3，NLR家族是一类进化上比较保守的蛋白质，对动物免疫功能的发挥起着重要作用。人类NLR家族已有至少22种成员，其中包括14个NLRP成员、5个NLRC亚家族成员、神经元性凋亡抑制蛋白NAIP(neuronal apoptosis inhibitor protein,NAIP)、NLRX和CIITA。目前研究较多的且与细胞焦亡相关的NLR家族炎性小体有NLRP1、NLRP3和NLRC4。NLRP3炎性小体是具有最广泛激活剂的炎性小体，它可以被病原微生物（如细菌、真菌、病毒、寄生虫等）、机体危险信号（如胞质钙离子、氢离子负荷、活性氧压力、钾离子外流、细菌mRNA、氧化线粒体DNA压力、溶酶体不稳定等）激活。目前研究发现的所有NLRP3激活剂都能够诱导细胞产生ROS，ROS可作为共同信号激活NLRP3炎性小体，并且ROS的抑制剂或清除剂能够抑制NLRP3炎性小体的激活。
研究发现在DN早期，存在肾小球足细胞和肾小管上皮细胞线粒体功能障碍，阻断线粒体ROS可减轻细胞损伤，线粒体来源ROS通过激活NLRP3炎性小体促进细胞的损伤，当细胞内所有线粒体内膜非特异性通透性孔道发生强烈改变时，细胞内ATP急剧下降，细胞产能系统遭到破坏，不能提供自噬或者凋亡所需能量，这时细胞发生焦亡。炎性小体的活化与糖尿病患者高血糖症及高胰岛素血症密切相关炎性小体能增强糖尿病患者的胰岛素抵抗，使患者血糖和胰岛素水平均明显升高[8]。高脂肪饮食喂养的糖尿病小鼠模型，发生胰岛素抵抗、糖耐量异常、其体内血糖含量、血胰岛素含量及细胞死亡数量均明显增加，caspase-1、NLRP3及ASC含量亦相应增高，提示伴随细胞焦亡过程。Jourdan等[9]通过制备2型糖尿病模型，发现内源性大麻素以一种大麻素受体依赖方式激活NLRP3炎性小体，从而使caspase-1活化，加重胰岛素抵抗和糖耐量异常等症状。敲除caspase-1和NLRP3的糖尿病小鼠，能有效改善胰岛素抵抗[10]。阻断炎性小体在未来糖尿病肾病的治疗中可能有广阔的前景。2型糖尿病T2DM(diabetesmelli-tustype2，T2DM)，主要是与细胞内TLR核苷酸结合寡聚化结构域样受体NLRs和NLRs蛋白过度激活有关，引发慢性炎症使得β细胞的大量死亡，TLR信号传导和NLRP3炎症小体的激活在其中起主要作用[11-13]。
另外，在多种原发性和继发性肾脏疾病中，IgA肾病、微小病变肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化、狼疮性肾炎、高血压肾病、新月体肾炎与急性肾小管坏死等，NLRP3表达水平显著上调，且与患者血肌酐水平、蛋白尿水平呈正相关，但正常肾脏组织中NLRP3表达水平很低，提示NLRP3炎性小体在人类急慢性肾脏疾病中也发挥显著作用。在各种肾脏病动物模型如单侧输尿管梗阻、抗肾小球基底膜肾炎、缺血再灌注损伤等模型中，NLRP3炎性小体活性显著增强。
2Caspase家族
Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteiny aspartate specific proteinase)，它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白（天冬氨酸）残基上的肽键。Caspase存在于细胞质中，偶见于细胞核，与真核细胞凋亡密切相关。在人类，Caspase家族已经鉴定了11种不同的caspase，依据其蛋白酶序列的同源性不同可分为3个亚族：Caspase-1亚族包括Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亚族包括Caspase-2、9；Caspase-3亚族包括Caspase-3、6、7、8、10。
研究发现，在Caspase家族中，Caspase-1介导了细胞的焦亡[14]Caspase-1以前称作白介素-1（IL-1β）转化酶，主要功能为参与细胞因子介导的炎性反应[15]；是首个被鉴定的哺乳动物Caspases酶。像所有的Caspase酶一样，Caspase-1在胞质中以非活性前体分子存在，参与构成炎性小体。激活的Caspase-1是焦亡性细胞死亡的核心执行者，外来病原体或者细胞内各种危险因素刺激细胞，促使细胞内装配形成炎性小体，炎性小体作用于pro-caspase-1，促使pro-caspase-1发生聚集，酶原发生自体水解，产生P20和P10两个亚基并形成异二聚体，异二聚体再进一步形成四聚体，最终形成具有活性的caspase-1。Caspase-1的活性通过多层水平进行调控。研究发现：（1）在转录水平方面，亨延顿相关蛋白-1与其相互作用因子形成的异二聚体可以增加caspase-1活性；（2）活化的caspase-1随着成熟IL-1β分泌到细胞外，细胞内caspase-1的含量下降；（3）目前发现两种修饰（PKA-1、Cys）可以在蛋白质翻译后修饰水平上改变caspase-1的活性；（4）多种负性调控因子(如蛋白酶抑制剂9、caspase-12及caspase-1的伪底物)及多种抑制炎性小体形成的机制，调解caspase-1的活性。既往认为CD4 T淋巴细胞的死亡属于细胞凋亡，现在认为约95%
T淋巴细胞的死亡属于细胞焦亡。
研究证实，糖尿病肾病个体中caspase-1介导了肾脏组织细胞的损伤，Caspase-1参与肾小球细胞焦亡及肾保护作用。在8周的糖尿病（db/db）小鼠中使用两种多酶抑制剂：M-920（抑制caspase-1）和CIX（抑制caspase-3），证实两种抑制剂都降低了肾小球细胞的焦亡，但只有m-920改善了糖尿病肾病，m-920的肾保护作用与肾小球caspase-1和炎症体活性的降低有关；另外糖尿病肾病患者和小鼠模型中的焦亡标记物（NLRP3、caspase1、pycard、IL-18、IL-1β）升高，但未出现凋亡标记物（casp3、casp7、parp1）；在体外，炎症激活标记物（NLRP3，caspase-1裂解）的水平高于糖化性足细胞凋亡激活标记物（caspase-3和-7，parp1裂解）的水平；最后，caspase-1缺乏能保护小鼠免受糖尿病肾病的影响，而敲除caspase-3没有显示出这种保护作用。因此，这些结果表明caspase-1依赖性炎症小体激活在DN中具有关键作用，caspase-3依赖性细胞死亡对DN肾固有细胞损害的影响较小；同时，Caspase-1缺陷或用药物抑制其活性，能避免这些疾病相关的炎症反应和细胞死亡，也提示糖尿病肾病病理损害过程中存在明显细胞焦亡。2013年YANG等在小鼠肾脏缺血再灌注模型中发现caspase-1，IL-β等焦亡相关蛋白表达增加；在NRK-52E细胞缺氧复氧模型中发现了细胞孔洞的形成及乳酸脱氢酶的释放。研究发现，在缺血再灌注，缺氧复氧发生前，内质网应激的标志物同源蛋白表达量增加，caspase-1，IL-β等焦亡相关蛋白的生成增加，表明内质网应激参与了缺血再灌注和肾小管上皮细胞的焦亡[16]。Xue[17]等研究发现，长链非编码RNA MALAT1参与了糖尿病肾病肾小管上皮细胞的焦亡过程，通过促进细胞焦亡下游caspase-1、IL-β、IL-1的生成，最终导致肾脏炎症反应和细胞焦亡。
3GSDMD Gasdermin D(简称GSMDM)
邵峰团队发现所有炎性caspase的一个共同底物蛋白是GSDMD，该蛋白质的切割对于炎性caspase激活引发细胞焦亡具有重要作用，目前研究GSDMD是细胞焦亡的执行者[18]。人GSDM蛋白是一类具有Gasdermin结构域的蛋白家族，包括GSDMA、GSDMB、GSBMC、GSDMD、GSDME及DFNB59共６个家族成员，之间具有45%的序列同源性[19]。现在研究与多种疾病（如肿瘤、免疫性疾病、神经系统疾病、耳聋等）的发生发展密切相关。
GSDMD是GSDM蛋白家族中研究最多、机制研究最完整的一种细胞焦亡相关蛋白，仅由炎性caspase-1、4、5、11激活，无法由凋亡或程序性坏死特异性上游分子激活，说明了GSDMD特异性地参与细胞焦亡的过程。近年研究表明：无论在经典或是非经典的焦亡途径通路中，caspase-1最终都会将焦亡信号传递给GSDMD蛋白去执行。GSDMD位于caspase-4/11/1的下游，被caspase切割后，形成活性基团GSDMD-N端和具有自抑制作用的GSDMD-C端，前者特异性地与细胞膜内类脂结合，形成许多直径为10-15nm的蛋白孔洞，胞外微小无机分子由此进入细胞导致肿胀，而肿胀的细胞在微生物感染和感染相关危险信号时会发生破裂，诱导细胞焦亡的发生[20]；C端具有亲水性,对细胞焦亡具有阻遏抑制作用。用静息状态下C端与N端通过长环相结合是其抑制细胞焦亡的基础，回补GSDMD后细胞焦亡仍可发生[19]。这可能与敲除GSDMD阻止了炎性因子分泌至细胞外有关。
另外，GSDMD虽然与IL-1β前体的成熟无关，却可独立介导IL-1β等炎症介质的释放和细胞膜的破裂、细胞的崩解[20]。韩家淮[21]团队研究证实无论经典或非经典途径的细胞焦亡都必须依赖焦亡执行蛋白GSDMD的介导，细胞中敲除过GSDMD后，PRO-IL-1β仍可被caspase-1切割成有活性的IL-1β，结果表明GSDMD与IL-1β的成熟无关，但却是成熟IL-1β释放分泌到胞外的必要条件。这也证实了GSDMD对于细胞裂解和炎性反应扩大的必要性。GSDMD在DN研究中仍未见报道，仍需要进一步研究。
4小结与展望
DN高发病率、多因素参与长期、慢性病程累及多脏器损害，预后差。细胞焦亡作为一种新的程序性细胞死亡方式正逐步被人们认识。目前，高糖、氧化应激、脂代谢异常、晚期糖基化产物等糖尿病危险因素对细胞焦亡影响的研究，显现出在糖尿病肾病治疗上有望取得突破，有可能在未来成为阻断糖尿病肾病进展有效治疗方法。目前研究仅停留在细胞水平和动物实验上，具体的作用机制尚不清楚。应完善已有的研究成果，进一步加大细胞焦亡与DN关系的基础研究，为糖尿病肾病的防护和治疗提供有效策略，成为了目前研究的迫切要求。
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