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【作者】 汤睿 王兵 唐思聪 刘炳亚 朱正纲
【关键词】结肠直肠肿瘤 肿瘤转移 预后 病理学 临床
【出版日期】2005-09-25
【摘要】目的:探讨Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测和淋巴结微转移对预后的影响。方法:于前瞻性研究31例行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌病人,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测所清除的398枚淋巴结中细胞角蛋白(cytokeratin,CK)20 mRNA的表达以检出微转移;经5年以上的随访,探讨淋巴结微转移对预后的影响和术后复发的可能原因。结果:在31例Dukes A、B期大肠癌病人的398枚淋巴结中,有15例(48.39%)共46枚(11.56%)淋巴结检出微转移。单因素分析提示微转移的淋巴结数量、位置及肿瘤生长方式与术后复发有关;Logistic多元回归模型提示,3枚以上淋巴结发生微转移与复发紧密联系。
结论:CK20 RT-PCR是检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移灵敏而特异的方法。3枚以上淋巴结发现微转移是预示复发的独立因素。
【刊名】外科理论与实践
淋巴结转移状况是判断大肠癌病人预后和指导术后化疗的重要指标[1,2]。常规的病理组织学检查在敏感性等许多方面存在不足,近年通过连续切片、免疫组化和逆转录聚合酶链反应(PT-RCR)等方法均可在部分苏木精-伊红(HE)染色阴性的淋巴结中检出微小转移[1]。笔者既往也曾应用RT-PCR法进行大肠癌淋巴结转移的检测,结果发现RT-PCR法检出淋巴结转移的敏感性高于HE染色,并能检出HE阴性淋巴结中的微转移灶[3]。DukesA、B期是指HE检查未发现淋巴结转移者,预后相对较好,但其中仍有10%～25%的病人在术后5年内出现复发[2]。因此本研究针对DukesA、B期病人,仍采用RT-PCR法检测淋巴结微转移,并探讨淋巴结微转移的发生对预后的影响。
材料与方法
一、病例资料和标本采集前瞻性研究。
所有病例均为1999年1～12月入我院普外科,实验终止于2004年12月。入组条件:①行根治性手术的大肠癌病人,经术后常规病理检查分期为Dukes A、B期;②术前无放、化疗史。术后定期检查随访,随访期均超过5年,排除失访者和因其他病因导致死亡的病例。至实验终止共收集31例病人。术后总随访期为60～70个月,期间记录病人的复发情况,死亡病人的生存期为手术至肿瘤转移复发死亡的时间,存活病人的生存期为手术至研究终止的实际时间。31例大肠癌病人中男17例,女14例;年龄32～80岁,平均(60.2±13.7)岁。结肠癌18例,直肠癌13例;Dukes A期5例,Dukes B期26例;肿瘤超过肠腔周径1/2者11例,未超过者20例;肿瘤呈膨胀型生长14例,浸润型生长17例;病理检查分化好5例,中等分化18例,分化差8例。手术切除的标本立即分离淋巴结并取一小块肿瘤组织,每枚淋巴结纵行切开,一半做常规病理切片HE染色,另一半与肿瘤组织液氮冻存直至RNA抽提。淋巴结总数为398枚,平均每例病人(14.7±6.3)枚。此外,取2例良性胃肠道病变的15枚淋巴结(1例胃溃疡病人10枚,1例直肠腺瘤病人5枚)作为阴性对照;取2例Dukes C期大肠癌病人的8枚HE染色阳性淋巴结作为阳性对照。
二、RT-PCR检测方法本
实验采用RT-PCR法定性检测淋巴结中细胞角蛋白(CK)20 mRNA的表达,同时选择管家基因GAPDH作为内参证明抽提RNA的完整性。Trizol试剂(华舜公司产品)抽提组织总RNA(具体步骤详见操作手册),取部分RNA样品稀释后测光密度(OD)值,OD260/OD280为1.8～2.0,并换算浓度。采用Access RT-PCR试剂盒(Promega),逆转录和PCR在同一试管、单一缓冲液中完成。每个RNA样品分别用CK20和GAPDH引物进行RT-PCR反应。反应体系25 lμ,含5×缓冲液5μl(终浓度为1)×,dNTP 0.5 lμ(终浓度0.2 mM),上游和下游引物各0.5μl(终浓度1μM),25 mMMgSO4 1 lμ(终浓度1 mM),AMV逆转录酶、TflDNA合成酶各0.5 lμ(终浓度0.1 M/μl)和1μg总RNA。加样完成后,轻微振荡混匀,放入PTC-100TM热循环仪(MJ Research)。首先48℃、45 min进行逆转录(cDNA第1链合成),然后94℃、2 min使AMV酶失活并使RNA/cDNA/引物变性,以后按以下条件合成cDNA第2链和进行PCR扩增。CK20引物存在时反应条件为94℃1 min、62℃2 min、68℃2 min共40次循环;GAPDH引物存在时为94℃1 min、63℃1 min、68℃2 min共30次循环,最后68℃7 min。引物序列如下:CK20,正义:5-′CAG ACA CAC GGT GAA CTA TGG-3,′反义:5-′GAT CAG CTT CCA CTG TTA GAC G-3;′GAPDH,正义:5-′ATG GCA CCG TCA AGG CTG AG-3,′反义:5-′CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3′。扩增终产物长度分别为370 bp和626 bp。同时用不加RNA的反应体系进行PCR扩增作为空白对照;不加AMV逆转录酶进行PCR扩增排除基因组DNA的污染。取10 lμRT-PCR产物在含0.5μl/ml溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,电泳后的凝胶由Floruo-S MultiImage全自动图像分析仪(BIO RAD)扫描并打印成像。PCR产物应用ABI PTISMBigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reac-tion Kit with AmpliTaq DNA Polymerase,FS(PerkinElmer),采用ABI PTISMTM 377XL DNA测序仪检测序列。
三、统计方法
大肠癌病人发生淋巴结微转移与各临床病理因素的相关性分析采用Fish确切概率法。生存率的计算采用Kaplan-Meier法,Log-rank检验比较不同组的生存率。各因素与复发的危险度单因素分析采用Mantel-Haenszel法,多因素分析采用Logistic回归模型。所有统计计算由SAS软件(v6.12)完成。
结果
一、样本检测结果
1.肿瘤、对照样本:31例大肠癌病人的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织(胃溃疡和直肠腺瘤组织)RT-PCR产物经电泳均可见370 bp的条带(图1),即表示有CK20 mRNA的表达;2例良性胃肠道病变的15枚淋巴结RT-PCR结果均为阴性(见图2),而2例Dukes C期病人的8枚HE染色阳性淋巴结RT-PCR结果均为阳性。以上标本GAPDH的RT-PCR产物均可见626 bp的条带,证实RNA完整无降解。不加RNA的反应体系作为空白对照进行PCR扩增结果为阴性;不加AMV逆转外科理论与实践2005年第10卷第5期录酶的反应体系进行PCR扩增结果为阴性,证实无基因组DNA的污染。将存在CK20引物的阳性PCR产物进行测序,结果与Gene Bank检索所获得的序列一致,提示RT-PCR结果正确。
2.大肠癌病人的淋巴结样本:31例Dukes A、B期大肠癌病人的398枚淋巴结中,有15例共46枚淋巴结RT-PCR结果为阳性(见图3),即存在微转移,淋巴结数阳性率为11.6%,例数阳性率48.4%。其中5例Dukes A期大肠癌病人的50枚淋巴结中有2例3枚淋巴结检出微转移;26例Dukes B期大肠癌病人共348枚淋巴结中有13例43枚淋巴结检出微转移。所有病例中发现有3枚以上淋巴结微转移者8例(25.8%),均为Dukes B期;发现N2站以上淋巴结微转移者9例(29.0%),也均为Dukes B期。
二、大肠癌出现淋巴结微转移与各临床病理因素的关系
31例Dukes A、B期大肠癌病人微转移的发生与病人的年龄、性别、肿瘤侵犯肠管周径、生长方式、分化程度和Dukes分期等临床病理因素均无显著相关(见表1)。
三、随访结果及预后
至研究终止,共有8例病人出现转移复发。其中5例为肝转移,3例局部复发,除2例术后发现肝左叶单发转移灶再手术切除目前分别存活63和68个月外,其余均死亡,5年生存率为80.6%。J Surg Concepts Pract 2005,Vol.10,No.5*:P<0.05;*Δ:经逐步回归P=0.0119,RR=0.090,95%CI 0.014-0.588;回归方程:P(1-P)=EXP(2.9186-2.4078X6)临床病理因素P年龄0.7098性别(男/女)0.7495侵犯肠管周径(≤1/2周/>1/2周)0.7679生长方式(浸润型/膨胀型)0.0184*分化程度(好、中/差)0.2554微转移淋巴结数(≥3/0～3)0.0059*Δ发生微转移淋巴结的位置(N2以上/N1或无)0.0155*生1.000.750.500.25存率0.000 10 20 30 40 50 60 70术后时间(月)a.根据有无微转移分组无微转移组(n=16)微转移组(n=15)P>0.05生存率1.000.750.500.250.000～2个阳性淋巴结组(n=23)3个以上阳性淋巴结组(n=8)P=0.00530 10 20 30 40 50 60 70术后时间(月)b.根据微转移淋巴结数量分组生存率1.000.750.500.250.00N0,N1(n=22)N2,N3(n=9)P=0.01240 10 20 30 40 50 60 70术后时间(月)c.根据微转移淋巴结位置分组图4不同微转移大肠癌病人的术后生存率表2 Dukes A、B期大肠癌复发原因的单因素分析临床病理因素阳性(n=8)复发阴性(n=23)P RR 95%CI年龄(岁)≥62/<62 4/4 12/11 1.0000 0.9375 0.2842～3.0926性别男/女4/4 13/10 1.0000 0.8235 0.2501～2.7119侵犯肠管周径≤1/2周/>1/2周3/5 8/15 1.0000 1.0909 0.3196～3.7240生长方式浸润型/膨胀型7/1 10/13 0.0454*5.7647 0.8021～41.4311分化程度好、中/差7/1 16/7 0.6417 2.4348 0.3517～16.8534微转移淋巴结数(n)≥3/0～3 5/3 3/20 0.0135*4.7917 1.4667～15.6545发生微转移淋巴结的位置N2以上/N1或无5/3 4/19 0.0272*4.0741 1.2233～13.6678*P<0.05表1大肠癌淋巴结微转移与临床病理因素的关系临床病理因素阳性(n=1 5)微转移阴性(n=16)P年龄(岁)≥62/<62 8/7 8/8 1.0000性别男/女8/7 9/7 1.0000侵犯肠管周径≤1/2周/>1/2周7/8 6/12 0.4928生长方式浸润型/膨胀型10/5 8/8 0.4725分化程度好、中/差12/3 11/5 0.6853Dukes分期A期/B期2/13 3/13 1.00001.淋巴结微转移对生存的影响:微转移组5年生存率为66.7%(10/15),无微转移组为93.8%(15/16),两组无显著差异(图4a)。3枚淋巴结微转移组的5年生存率为50.0%(4/8),而少于3枚组为91.3%(21/23),两组差异显著(图4b)。N2站及以上淋巴结微转移组的5年生存率为55.6%(5/9),N1站及无转移组为90.9%(20/22),两组差异显著(图4c)。2.复发危险度分析:单因素分析提示,肿瘤呈浸润型生长、>3枚淋巴结和N2站以上淋巴结有微转移与复发关系显著(表2)。Logistic回归分析提示,>3枚淋巴结有微转移是复发的独立因素(表3)。表3 Dukes A、B期大肠癌复发原因多元Logistic回归分析外科理论与实践2005年第10卷第5期
讨论
一、大肠癌淋巴结微转移的检测方法
淋巴结转移与否是判断大肠癌预后和指导术后化疗的重要指标。长期以来,临床上采用病理切片HE染色判断淋巴结的转移情况,并将无远处转移、HE染色未发现淋巴结转移者定义为Dukes A、B期。但仍有10%～25%组织学证实淋巴结阴性的病人在术后5年内出现复发[2],近年用连续切片、免疫组化和PT-RCR等多种方法对HE染色阴性淋巴结进行检测,均发现其中的部分淋巴结存在微转移[1]。因此,用HE染色法检测淋巴结转移的敏感性是不够的。其他方法中,连续切片法工作量过大,临床难以推广。免疫组化法尽管有助于检出淋巴结微转移,但目前可供选择的抗体其特异性和敏感性还不能满足诊断的要求,作为一种形态学方法,还存在阳性判断标准不一致的缺点,且切片的数量有限,不足以反映整个淋巴结的情况,能否作为预后指标也存在争议[1,4～6]。RT-PCR法通过逆转录并扩增正常被检组织不表达而肿瘤或肿瘤来源组织表达的mRNA以证实微转移的存在,由于PCR强大的扩增效应,具有很高的敏感性,可以在105～107个正常细胞中检出1个肿瘤细胞[1,3]。本实验选择的靶RNA是CK20 mRNA,CK20是一种细胞骨架蛋白,在正常人体内的表达主要局限于胃肠道上皮,而在正常淋巴结的淋巴细胞和上皮细胞中不表达[7],同时CK20在几乎所有大肠癌组织中均表达[8],因此具有较高的特异性,是目前用于大肠癌微转移检测的最常用指标之一。本实验中所有大肠癌病人的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织均表达CK20 mRNA,而2例良性胃肠道疾病的15枚阴性淋巴结均不表达,证实CK20 RT-PCR具有较高的特异性。31例病人的398枚淋巴结中,有15例46枚淋巴结发现微转移,说明该法能发现Dukes A、B期大肠癌淋巴结的微转移,淋巴结微转移在Dukes A、B期大肠癌病人中并不少见。
二、淋巴结微转移检测的临床意义及其对预后的影响
在较早开展研究的乳腺癌[9]和黑色素瘤[10]研究报道中,认为淋巴结微转移检测对预后有影响,并已用于前哨淋巴结的检测。而对于大肠癌,其意义仍存在争议,有认为淋巴结即使存在微转移也已被切除;也有认为由于敏感性过高,检出的肿瘤细胞并不具有活性。对预后的影响有不同的报道结果,免疫组化方面报道多认为对预后无影响[1],RT-PCR的一些报道则认为其是影响术后复发和生存的重要因素[11,12]。其实这些结果都可从以下方面来理解和解释:①淋巴道是大肠癌早期转移的重要途径,淋巴结存在转移也间接提示其他部位存在微小转移,只不过常规检查未能发现而已,这也就是为什么大部分Dukes C期病人虽进行了包括淋巴结清扫的根治术,但仍有不少病人术后复发,且多数为肝转移和局部复发而非淋巴结;此外,近年提出的“淋巴血管生成”理论也是重要佐证[13];②仅一部分微小转移的肿瘤细胞最终能发展形成显性转移,其发生与转移肿瘤细胞本身的基因型、表型、局部微环境以及是否能诱导肿瘤血管生成等诸多因素有关[13];③各实验室采用的方法、操作步骤不统一,研究样本较小。从本研究的结果来看,如将病例分为淋巴结微转移组和无微转移组,尽管前者的5年生存率低于后者,但统计学无差异。如按照淋巴结个数或分站进行比较,有3枚淋巴结微转移组病人的生存率显著低于3枚以下组,N2及以上淋巴结微转移组的生存率显著低于N1及无转移组,提示微转移负荷量和到达位置可能较单纯显示微转移存在对于推断预后更有价值。对复发因素进行危险度分析,单因素分析发现浸润型生长、3枚以上淋巴结和N2以上淋巴结发生微转移与复发关系显著;多元回归分析,3枚以上淋巴结发生微转移是复发的独立预后因素。提示Dukes A、B期病人如发现这些情况,则是复发的高危病例,应该进行更积极的随访观察和治疗,比如对这些Dukes A期病人也应进行化疗,Dukes B期病人应调整放、化疗方案,随访检查应更加细致等。
三、技术更新和前景
前文曾提到RT-PCR法的一些不足和局限[3],近年来技术方法的改进使情况有所改善,如采用定量RT-PCR法[14]使实验更加快捷、简便,也有助于减少假阳性率;通过显微切割技术[15]已能够抽提蜡块组织的mRNA,使大规模的回顾性研究成为可能。虽然本研究是国内首例报道RT-PCR检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移对预后影响的前瞻性研究,但仍然只是一个小样本研究。对于是否可以将有淋巴结微转移的Dukes A、B期病人提J Surg Concepts Pract 2005,Vol.10,No.5升为C期,是否可将此作为指导放、化疗的指征等问题,仍然需要统一规范操作的大样本、多中心研究才能得出结论。总之,CK20 RT-PCR法是检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移较为敏感而特异的方法,发现微转移的淋巴结数量、位置和肿瘤生长方式与术后复发有关,3枚以上淋巴结发生微转移是复发的独立预后因素。Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测及其对预后的影响@汤睿$上海第二医科大学附属第九人民医院普外科!上海200011 @王兵$上海第二医科大学附属第九人民医院普外科!上海200011 @唐思聪$上海第二医科大学附属第九人民医院普外科!上海200011 @刘炳亚$上海第二医科大学附属瑞金医院普外科上海消化外科研究所!上海200025 @朱正纲$上海第二医科大学附属瑞金医院普外科上海消化外科研究所!上海200025结肠直肠肿瘤;;肿瘤转移;;预后;;病理学,临床目的:探讨Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移的检测和淋巴结微转移对预后的影响。方法:于前瞻性研究31例行根治性手术的Dukes A、B期大肠癌病人,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测所清除的398枚淋巴结中细胞角蛋白(cytokeratin,CK)20 mRNA的表达以检出微转移;经5年以上的随访,探讨淋巴结微转移对预后的影响和术后复发的可能原因。结果:在31例Dukes A、B期大肠癌病人的398枚淋巴结中,有15例(48.39%)共46枚(11.56%)淋巴结检出微转移。单因素分析提示微转移的淋巴结数量、位置及肿瘤生长方式与术后复发有关;Logistic多元回归模型提示,3枚以上淋巴结发生微转移与复发紧密联系。
结论:CK20 RT-PCR是检测Dukes A、B期大肠癌淋巴结微转移灵敏而特异的方法。3枚以上淋巴结发现微转移是预示复发的独立因素。
参考文献
[1] 汤睿, 唐思聪, 郭善禹. 大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义[J]. 癌症,2000(10):57-62.
引证文献
[1] 谭卫民, 罗时敏, 葛轶群. 大肠腺瘤癌变123例外科治疗[J]. 广东医学,2007(05):41-43.[2] 唐晓健, 朱正纲. 早期胃癌与淋巴结微转移[J]. 外科理论与实践,2008(03):97-99.[3] 唐晓健（综述）, 朱正纲（审校）. 早期胃癌与淋巴结微转移[J]. 外科理论与实践,2008,13(3):276-278.[4] 钱跃军. AP-4在结直肠癌局部淋巴结中的表达与结直肠癌复发相关性的研究[D].广州医学院,2010.
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