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摘要：理论联系实际，设计一种关于生物修复技术的创新实验方法。通过植物-微生物的有效联合，探讨土壤石油烃污染问题，从而将书本中的理论联系实践，锻炼学生提出问题、分析问题、解决问题的能力，让学生熟悉并掌握分子生物学领域中的一些基本实验操作技术，掌握PCR仪器及高效液相色谱的使用，通过创新实验激发学生的科研兴趣，为大学生创新能力的开发和培养提供平台。
关键词：印度梨形孢；紫花苜蓿；石油烃；土壤污染
本文引用格式：武洪庆,等.基于“土壤污染生物修复技术”培养学生创新能力[J].教育现代化,2019,6(21):30-31.
科技创新是提高社会生产力和综合国力的战略支撑。高校推进素质教育中的一项重要举措就是科技创新教育，科技创新教育是培养大学生创新精神和实践能力的重要载体，也是高等教育进行素质教育的重要形式和内容之一。目前高校采用的将大学生的科技创新融入到教师科研的方式是实现科技创新教育的一条切实有效的途径[1]。大一、大二学生利用课余时间进行创新实验是培养大学生综合实验能力的良好时期，有助于激发大学生的科技创新意识，推动科技创新教育的发展。石油污染土壤是目前环境污染中的一个主要问题，石油污染造成土壤肥力降低，作物产量下降，并且还是水污染的来源之一。植物联合根际微生物修复土壤污染的技术是目前相较于传统工程方法更好的替代技术，具有高效，环保等特点，被誉为绿色修复技术，在环境修复方面显示出极强的潜力[2]。该实验所涉及到的微生物材料是内生真菌印度梨形孢（P.indica）[3]，所采用的植物是紫花苜蓿（Medicago sativa）[4]。该实验目的是基于微生物联合植物共同修复土壤石油烃污染探究来促进大学生科技创新能力的开发与培养。通过该实验课程激发学生的科研兴趣、锻炼和提高学生文献检索、设计和操作实验、实验数据处理、实验结果分析、总结和归纳的能力。
一选题阶段
该科技创新团队由6个学生、2名指导教师组成。利用学生的课余时间进行，指导教师首先给出所要查阅文献的关键词，学生查阅文献，通过阅读大量文献写一篇3000字左右的文献综述，了解生物修复研究领域的国内外研究现状。从而确定自己所要研究的生物修复材料，设计并确定实验方案。
二 实验阶段
（一）实验步骤
(1)印度梨形孢培养及孢子悬浮液收集
(2)植物的萌发和接种
(3)土壤中植物培养与取样
（二）数据测定
(1)印度梨形孢的定殖观察实验操作见参考文献[5]。
(2)土壤微生物呼吸的测定
(3)土壤FDA水解酶活性的测定实验操作见参考文献[6]。
(4)半定量PCR法检测基因表达Trizol法提取植物RNA；鼎国试剂盒法RT-PCR；半定量检测基因表达。
(5)高效液相色谱法（HPLC）测定不同土壤石油烃组分含量变化实验操作见参考文献[7]。
（三）结果与讨论
(1)印度梨形孢定殖提高植物的生物量
在正常土壤中，经印度梨形孢定殖的苜蓿较空白对照长势更好，叶片数目密集，茎长；Ⅱ型石油污染处理下的苜蓿植株较小，叶片少；而当加入印度梨形孢后，苜蓿植株在大小、叶片数量以及茎长方面均有一定程度的提高。说明印度梨形孢定殖苜蓿能增加植物生物量并缓解石油胁迫对植物造成的伤害。
(2)印度梨形孢联合紫花苜蓿提高土壤FDA水解酶活性
相同处理下，紫花苜蓿根际土的荧光素吸光度值要大于非根际土的，这是由于根际微生物的存在，使得根际土壤的微生物活性要比非根际土壤的微生物活性高；有印度梨形孢定殖的植株，其根际土荧光素吸光度值大于同种土壤处理方式下没有印度梨形孢定殖的。这说明，印度梨形孢的存在可以使植株根际微生物活性提高，从而改善根际土壤，使植物更好地生存，提高其生物量。
(3)HPLC测定不同处理条件下土壤石油组分含量变化
高效液相色谱法对微生物与植物协同处理下的土壤样品进行定量分析。通过与对照组比较发现，紫花苜蓿接种了P.indica后，土壤中的石油烃含量明显减少，并且组分也有一定程度的改变。由实验结果我们初步得出结论：经过微生物与植物联合修复的土壤石油含量减少，石油组分发生改变，分析原因可能是石油烃中的长链烷烃被降解，变成短链烷烃的结果。
(4)基因表达检测
植物细胞在环境胁迫下产生系统获得性抗性防卫反应，一类称为病程相关蛋白（PR）会发生含量变化。本实验中检测了紫花苜蓿在不同土壤类型，不同接种条件以及不同时间点的条件下，PR1和PR10基因差异表达的情况。结果显示，在没有石油烃胁迫条件下，接种印度梨形孢能诱导PR1和PR10的表达，另外，PR1和PR10的表达也受到了石油烃污染的影响；此外，随着胁迫时间的增长，PR1和PR10的表达量也进一步积累。实验结果说明病程相关蛋白的基因表达既受到生物胁迫的影响，又受到非生物胁迫的影响。该蛋白的表达对促进植物与微生物的协同作用，联合修复石油烃污染具有深远的意义，其机制还有待于进一步挖掘。
（四）实验小结
通过微生物联合植物修复土壤石油烃污染实验，让学生掌握了分子生物学实验技能，熟悉了显微镜、摇床、培养箱等基本仪器的使用，还使用了PCR仪器、高效液相色谱仪、凝胶电泳等精密仪器。学会了用office办公软件处理实验数据，通过前期的实验设计，动手操作和数据分析锻炼了学生的观察能力、分析问题和解决问题的能力。
三 实验总结阶段
历时6个月的集中学习和实验，学生收集了较多的实验结果和数据。实验结束后，学生需要分析实验数据，撰写实验报告，分享实验心得，讨论并设计下一步工作计划，教师综合学生的操作技能、数据分析能力和对后期工作设想等各方面给出科技创新实验的综合成绩。
四 创新实验效果
通过科技创新实验培养了大学生探究能力和创新意识。学生在老师的指导下，经历了系统而又全面的科技创新实验流程：明确研究方向、查阅文献、完成开题报告、设计实验方案、操作实验、分析实验现象和数据、归纳总结、撰写实验报告以及构建下一步工作计划，完成了一个科技创新实验的课题。创新实验以科技创新为主题，从自主性、探索性、实践性和协作性等方面出发，既培养了大学生的科研兴趣，又提高了大学生的主观能动性和科技创新能力，而且让大学生体会到了团队合作的重要性。在一定的时间范围内，取得了阶段性的进展成果，培养了科研自信心，使得大学生能根据现阶段成果，有效开展下一步工作计划，取得了很好的创新实验效果。我们将保持并持续改进创新实验的积极效果，通过老带新的“传帮带”机制，形成一个“探索-总结-改进-创新”的科技创新实验项目，为培养大学生科学实践、科技创新能力提供机会和平台。
参考文献
[1]杨琳.大学生创新能力培养与高校素质教育[J].中国电力教育,2009(13):6-7.
[2]Xun Y,Feng L,Li Y,et al.Mercury accumulation plant Cyrtomium macrophyllum and its potential for phytoremediation of mercury polluted sites[J].Chemosphere,2017,189(2):161-170.
[3]楼兵干,孙超,蔡大广.印度梨形孢的多种功能及其应用前景[J].植物保护学报,2007,34(6):653-656.
[4]孔德康,王红旗,刘自力,等.植物-微生物修复石油烃污染土壤与根际微生态环境变化[J].生态毒理学报,2017(3):644-651.
[5]支添添,周舟,韩成云,等.台盼蓝染色鉴定拟南芥sdl1突变体的细胞死亡[J].作物研究,2013,27(3):217-218.
[6]蒋炳伸,李鸿雁,杨喜田.应用荧光素二乙酸脂水解酶活性研究不同绿地土壤微生物活性[J].河南农业科学,2011,40(8):130-133.
[7]姜岩,伍涛,张贤明.土壤中石油烃预处理及含量分析方法研究进展[J].土壤,2015,47(3):461-465.
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