分析多角度光散射在药物质量控制中的应用价值论文

 

　　关键词：药物质量控制,多角度光散射,应用价值

 

 

　　光散射技术在推动光散射检测仪器的研发与应用方面具有举足轻重的作用，例如多角度光散射器、小角度光散射器以及直角光散射器等。在高分子化合物特征分析等研究领域，光散射技术得到了广泛应用。其中，大分子化合物的散射光强度受到角度的影响较大，而在0°角下无法进行物理测量。然而，这一难题可通过相关技术得到有效解决[1]。目前，三角度、八角度及十八角度光散射检测器为主要应用的多角度光散射设备。其中，十八角度光散射器应用最为广泛，可与示差检测器和紫外检测器等配合使用，从而显著拓宽了测试领域。示差检测器和紫外检测器联合检测可对相对分子质量进行测定，以特性黏度测定为主要方式，也可显示相对分子质量分布信息，从而可更有针对性地判断样品构象。联合检测仪器不但可对生物大分子的相对分子质量情况和分布情况进行检测，还可使大分子聚集状态与构象等获得表征[2-3]。多角度光散射技术在药品质量控制中的应用价值较高且前景较好，本文针对多角度光散射技术原理、特点与药品关键质量属性测定情况进行综述分析。

 

 

　　静态光散射和动态光散射均属于光散射技术的范畴。静态光散射技术通过测量平均散射光光强对角度和浓度的依赖性，可以确定化合物的均方根旋转半径、分子质量以及分布状况等参数。而动态光散射则是通过记录时间相关函数，分析散射光特性的弛豫时间，从而了解相应的粒径大小，并有助于明确平均扩散系数。联合静态光、动态光散射能够分析溶液中高分子粒子等的质量变化情况，也可研究流体力学变化过程[4]。

 

 

　　2.1相对分子质量与分布

       2.1.1大分子药物

 

　　大分子药物传统测定方法包括质谱法（MS）、分子排阻色谱法（SEC）及凝胶色谱法（GPC）等。其中，MS能够对化合物中相对分子质量进行准确测定，电喷雾离子阱质谱、基质辅助激光解吸-飞行时间质谱法等均可测得相对分子质量分布较窄的高分子化合物（Mw）。GPC无法对大小接近的目标分子化合物进行准确分辨，而且色谱容易老化。凝胶电泳-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）需要大量样品方能够保证蛋白质相对分子质量测定结果的准确性，同时还存在重现性差及操作烦琐等缺点。MS有着较强的电离源适用性，难以准确分析多分散复杂体系。除了非变性形式外，公用纳生电喷雾离子源-轨道阱质谱仪在单克隆抗体药物的相对分子质量鉴定方面表现出较高的实用价值，该技术还可对激进型糖型进行鉴定，在测量质谱源内碎裂程度时，可采用中等强度的源内碎裂参数进行评估，这主要源于质谱仪分辨率较高，实际信号谱图分辨率不低于4000，故而为了防止发生完整药物碎裂现象可在增强去溶剂化效果时将碰撞诱导裂解启动。现阶段，GPC-MALS及SEC测定相对分子质量获取的结果与真值极为接近，可对大分子相对分子质量进行快速测定[5]。

 

　　Nicole等[6]建立了SEC-MALS通用法，主要利用了病毒衣壳和包括光散射、DNA折射与固有吸光度等特点，既能够测定表征腺相关病毒含量，还可针对完整性进行判断，除此之外，还能够测定衣壳大小、聚集状态以及载体基因摩尔质量等，为腺相关病毒载体基因治疗药物的研发提供了重要支持。Amartely等[7]采用MALS联合离子交换色谱对有着较高相似度的分子质量蛋白质进行区分，同时对蛋白质中低聚物实施分离，上述方法可确定单体以及二聚体、三聚体相对分子质量。

 

　　现阶段，通过GPC法进行核酸相对分子质量测定具有进程缓慢以及操作难度大等缺点，而且需要应用染色剂与甲醛，而且此检测方法检测结果容易受多种因素的影响，准确性不高，SEC-MAL法能够为核糖核酸质量控制提供新的参考。

 

　　2.1.2中药

 

　　光散射技术在中药多糖成分研究中有着广泛应用，如灵芝菌丝体多糖、注射用黄芪多糖、蛹虫草多糖及茯苓多糖等。多糖识别特征包括相对分子分布情况以及质量情况等，多糖质控指标包括Mn及Mw等，可反映多糖组分纯度。多糖相对分子分布情况以及质量情况测定方法主要包括SEC法和GPC法等，如甘草多糖等。但是以多糖成分作为质控指标的质量标准仍然存在诸多缺点，如多糖标准品获取难度较大、含量测定方法的专属性欠缺、缺乏特异性鉴别反应等。将多角度光散射技术应用于多糖组分研究中有着非常明显的优势[8-9]。

 

　　有研究将SEC-MALS联用技术应用于芦荟多糖相对分子质量的检测中，与SEC-MALS法、经葡聚糖标准校准的亚铁氰化铁法相比，不同检测方法的结果差异较大，待测物与标准品结构有着较为明显的组成差异，与SEC效应核多糖间相互作用无显著关联。多糖有着较高的复杂度，故而以单一多糖为标准对未知多糖中相对分子质量进行测定的方式不可取，多角度光散射法的可靠性更强。有研究表明[10]，应用GPC-MALS联用技术测定铁皮石斛多糖，不同种源铁皮石斛多糖相对分子质量与分布差异明显。多角度光散射技术在菌种筛选与多糖定性鉴别中也有着较高的应用价值。Zhu等[11]应用HPSEC-MALS-RI技术等提取糖类凝胶电泳糖类图谱，比较不同地区的丹参多糖，表明相对分子质量差异不明显。

 

　　2.1.3辅料

 

　　辅料为药物制剂生产与应用的前提和基础，与药物疗效以及用药安全性存在较高的关联。药物辅料增稠剂相对分子质量及稀释剂粒径等可对液体制剂黏度和固体制剂成型性以及制剂质量安全产生影响。Kpodo及Grube等研究[12-13]中多糖摩尔质量高于木槿多糖、黄蜀葵多糖及黄秋葵多糖，但是较药葵多糖低，可见能够自锦葵科植物中获取宽范围相对分子质量多糖。现阶段，多角度光散射在透明质酸、壳聚糖、葫芦巴胶等药用辅料中有着广泛的应用。

 

 

　　多角度光散射技术具有操作快捷、测定简便等特点，在脂质纳米颗粒、丙戊酸多糖、脂质体及香菇多糖等脂质体纳米粒产品检测中大量应用，也可进行处方筛选[14]。小角X射线散射能够与AF4-MALS-DLS法协同表征包裹紫杉醇前后二硬脂酰磷酰乙醇胺-聚乙二醇聚合物胶束（PM）血浆的清除速度，介质中PM存在形式为高度组织化，包裹药物后PM簇形成[15]。SAXS拟合参数表明药物包裹前后平均粒径变化不明显，聚乙二醇构象能够变化形状，如可由刷状向蘑菇状转变，相比于内含紫杉醇的PM，空白PM体内循环需要时间更长，可提高新型药物递送系统制备中的胶束内部结构及表征的准确性。

 

　　场流分离（FFF）-MAL法可突破凝胶固定相排阻极限的限制，包括渗透极限在内的局限性也可得到克服，在大分子药物分离中的价值较高，也适用于定量分析。FFF-MAL法可与不同技术手段联合应用，包括SEC-MAL、透射电镜、原子力显微镜和快速定量聚合酶链反应等，可在不同生长条件下对疫苗候选病毒的聚集状态进行观察，也可获取分布期情况、生长数量等信息，有利于筛选目标病毒疫苗。

 

 

　　多角度光散射技术明确纯化蛋白质，如对单体、寡聚态进行鉴别等，可明确寡聚化程度、蛋白翻译后多分散性情况，还可判断修饰程度，多分散性包括蛋白质-多糖聚合物、蛋白质-核酸、蛋白质-蛋白质形成等，可为评估蛋白质构象以及单体-二聚体平衡解离常数等提供参考。

 

　　液相色谱法在蛋白质分析中有着广泛的应用，但是由于蛋白质存在亲水性和疏水性等特点，故而液相色谱法分辨率与回收率均较低。反相超高效液相色谱法-MAL法可使多种完整单克隆抗体于Fc及Fab片段获得表征，还可通过SEC-MALS法进行验证。联合MALS法及RP-UPLC法能够得出单克隆抗体洗脱峰，明确Fc、Fab片段的相对分子质量。相比于SEC-MALS法，IEX-MALS法分离原理差异较大，RP-UPLC-MALS法可对蛋白质中的低聚物进行分离表征。

 

 

　　聚合物、多糖类辅料的关键属性均为支化度，结构存在多样性的特点，支化度表征能够控制药物缓释。Smith降解不同支化度β-1,3-D-葡聚糖三螺旋构象分析方式包括差示扫描量热分析法及SEC-MALS等，经Smith降解获得的裂叶多糖支化度下降，物质量分布不明显，水中修饰程度较低，分子构象未发生明显改变[16]。

 

 

　　多角度散射技术能够对大分子相对分子粒径、质量以及酯化度、扩散系数等参数进行快速测定，分子排阻色谱－多角度散射（SEC-MALS）联用技术可明确样品洗脱图中各级分点物质量，也可掌握分子质量，即便不以标准品作为参照，也能够对相对分子的质量和分布情况进行明确，同时还能够保证结果的准确性。除此之外，还能够获取低浓度至高浓度相对分子质量混合物中组分的相对分子质量以及聚集态与分支程度等。多角度散射技术在多肽、多糖、蛋白质-核酸复合物以及表面活性剂、表征蛋白质单体及聚集体等多个领域有着广泛应用，属于重要的表征手段，在药品质量控制中的应用价值较高且应用前景较好。

 

 

　　[1]Fan Y,Khgo DM,Martin RW,et al.Bayesian analysis of static light scattering data for globular proreins[J].Plos One,2021,16(10):e0258429.

 

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　　[3]Kushnir D,Beyer N,Bartshch E,et al.Wide-angle static and dynamic light scattering under shear[J].Rev Sci Instrum,2021,92(2):25113.

 

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　　[5]代荣荣,马鑫,邵心阳,等.基于纳升电喷雾-轨道阱超高分辨率质谱对完整单克隆抗体药物进行相对分子质量测定及糖型鉴定的条件探究[J].分子测试学报,2020,39(1):1643-1645.

 

　　[6]Ni c o l e L M,G e o ff r e y Y B,O m a i r A K,e t a l.C o m p r e h e ns iv e c ha r a ct e r iz ation a nd quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light sacttering[J].Sci Rep,2021,11(1):3012.

 

　　[7]A martely H,Avr a ham O,Friedle A.Coupling multi angle light scattering to ion iexchange c hr o matog ra phy(I EX-MALS)f o r p r ot e in characterization[J].Sci Rep,2018,8(1):6907.

 

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